1、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 鎘對(duì)小鼠腎臟的急性毒性作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)者：葉佳增 3120304126 黃輝武 31203041271、 實(shí)驗(yàn)背景及依據(jù)：隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅猛發(fā)展 ,環(huán)境污染對(duì)人體健康的影響日益嚴(yán)重 ,有關(guān)環(huán)境有毒物質(zhì)對(duì)機(jī)體的毒性作用及其機(jī)制的研究受到普遍關(guān)注。鎘 ( cadm ium , Cd )是一種極其重要的工業(yè)和環(huán)境化學(xué)污染物 ,因其對(duì)環(huán)境水、空氣和土壤的污染而在動(dòng)植物體內(nèi)蓄積 ,最終導(dǎo)致對(duì)人類健康的危害 ,并由于它在體內(nèi)能長(zhǎng)期蓄積 ,不易排除 ,故易產(chǎn)生慢性的和遠(yuǎn)期的病理效應(yīng) ,可損傷許多組織和系統(tǒng)。在人和動(dòng)物慢性鎘中毒最常見的癥狀是生長(zhǎng)遲滯、腎功能衰竭、生殖功能減退、高血壓、腫

2、瘤和畸胎等。鎘污染問(wèn)題已受到世界各國(guó)高度重視 ,美國(guó)毒性管理委員會(huì) ( ATSRD ) 已把鎘列為第六位危害人體健康的有毒物質(zhì) ,聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署 (DNFP)也把鎘列入重點(diǎn)研究的環(huán)境污染物 ,世界衛(wèi)生組織 (WHO )則將其作為優(yōu)先研究的食品污染物。我國(guó)是重金屬豐產(chǎn)國(guó)家 ,鎘污染現(xiàn)象也相當(dāng)嚴(yán)重 1 。來(lái)自不同領(lǐng)域的研究分別試圖從整體水平、器官系統(tǒng)水平和細(xì)胞分子水平闡明鎘對(duì)機(jī)體的毒性作用及其機(jī)制 ,以便為預(yù)防及治療由其引起的疾病提供有效的方法。因此 ,研究鎘污染對(duì)生物體的毒性作用及保護(hù)對(duì)策具有重要理論意義和實(shí)踐指導(dǎo)價(jià)值。2、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x： 目的：了解鎘的急性損害作用，鎘對(duì)腎臟毒性的蓄積作用

3、 意義：通過(guò)了解鎘的急性作用，掌握鎘的危害，同時(shí)積極預(yù)防鎘的污染。掌握隨機(jī)分組方法，以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：1、氯化鎘（CdCl2、AR）、蒸餾水、0.9%生理鹽水2、小鼠肌酐ELISA試劑盒（ 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊(96孔)、標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)：2瓶(凍干品)、樣品稀釋液(Sample Diluent)：120ml/瓶、生物素標(biāo)記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent)：110ml/瓶、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液(HRP-avidin Diluent)：110ml/瓶、生物素標(biāo)記抗體(Biotin-antibody)：112

4、0l/瓶(1：100)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin)：1120l/瓶(1：100)、底物溶液(TMB Substrate)：110ml/瓶、濃洗滌液(Wash Buffer)：120ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍、終止液(Stop Solution)：110ml/瓶(2N H2SO4) ）3、小鼠尿微量白蛋白酶聯(lián)免疫分析盒（48孔配置96孔配置封板膜2片、酶標(biāo)包被板 148 196（2-8保存）、標(biāo)準(zhǔn)品540g/L 0.5ml1瓶 0.5ml1瓶 、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml1瓶 1.5ml1瓶、酶標(biāo)試劑 3 ml1瓶 6 ml1瓶、樣品稀釋液 3 ml1瓶 6 ml1

5、瓶（2-8保存）、顯色劑A液 3 ml1瓶 6 ml1瓶、顯色劑B液 3 ml1瓶 6 ml1瓶、終止液 3ml1瓶 6ml1瓶、濃縮洗滌液 20ml20倍1瓶 20ml30倍1瓶 ）4、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀、高速離心機(jī)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、干凈的試管、Eppendof管、系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭、容量瓶、移液槍5、動(dòng)物秤、灌胃針、毛細(xì)管、潔凈帶刻度容器、外科剪、鑷子、濾紙6、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年清潔級(jí)昆明種小鼠49只，雌雄各半，體重2027g，由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。四、預(yù)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)將9只健康成年小鼠分為3組，分別給予藥物劑量0、0.20、5.00mg/kg，如果最大劑量組有死亡沒全死，應(yīng)加大劑量找出全死劑量，

6、如果全沒死，則應(yīng)考慮做最大耐受量。然后根據(jù)摸索出來(lái)的0100%致死量之間選擇4個(gè)劑量組做實(shí)驗(yàn)。五、實(shí)驗(yàn)方法：1、分組與稱重 將40只小鼠雌雄各半，隨機(jī)分為4組，共8組；分別稱量小鼠體重，并做好記錄。2、染毒以生理鹽水配置CdCl2溶液，CdCl2染毒劑量分別為0.05、0.10、0.20mg/kg，染毒組小鼠進(jìn)行灌胃染毒（10mg/kg體重），對(duì)照組注射生理鹽水（10mg/kg體重），動(dòng)態(tài)觀察小鼠的癥狀和體征。3、 收集尿液 每隔1小時(shí)，用潔凈帶刻度容器收集小鼠尿液（采用反射排尿法：提起小鼠尾巴，將其倒立，尿液便流出）。4、 血清肌酐含量的測(cè)定4.1采用后眼眶靜脈叢取血法進(jìn)行采血，采血量1ml

7、，編號(hào)。4.2血清制備：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。4.3加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)血清樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00l，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。4.4棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100l(取1l生物素標(biāo)記抗體加99l生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制)，37,60分鐘。4.5溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干

8、，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350l/每孔，甩干。4.6每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液(同生物素標(biāo)記抗體工作液) 100l，37，60分鐘。4.7溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350l/每孔，甩干。4.8依序每孔加底物溶液90l，37避光顯色(30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止)。4.9依序每孔加終止溶液50l，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。4.10用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光

9、密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。5、處死、剖腹采尿與腎臟提取5.1 5小時(shí)后分別稱量小鼠體重，記錄數(shù)據(jù)；5.2頸椎脫臼法處死，處死后剖腹暴露膀胱，用無(wú)齒小平鑷夾住一小部分膀胱，迅速持針在小鑷夾住的膀胱部位直視穿刺抽取尿液，收集在前述的潔凈帶刻度的容器內(nèi)。5.3并立即取出腎臟并剝離周圍脂肪及結(jié)締組織，用生理鹽水洗凈后用濾紙吸干，稱量肝臟重量，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算臟器系數(shù)。6、尿微量白蛋白含量的測(cè)定6.1 尿液的收集與處理2000-3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘左右，仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。6.2 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔

10、中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100l，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻，然后從第一孔、第二孔中各取100l分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻，然后在第三孔和第四孔中先各取50l棄掉，再各取50l分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻，混勻后從第五、第六孔中各取50l分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50，混勻后從第七、第八孔中分別取50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻后從第九第十孔中各取50l棄掉。稀釋后各孔加樣量都為50l，濃度分別為360g/L、240g/L

11、、120g/L、60g/L、30g/L。6.3 加樣分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔，空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40l，然后再加待測(cè)樣品10l，樣品最終稀釋度為5倍。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。6.4 溫育用封板膜封板后置37溫育30分鐘。 6.5 配液將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。6.6 洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。 6.7 加酶每孔加入酶標(biāo)試劑50l，空白孔除外。6.8 溫育用封板膜封板后置37溫

12、育30分鐘。6.9 洗滌6.10 顯色每孔先加入顯色劑A50l再加入顯色劑B50l輕輕震蕩混勻37避光顯色15分鐘. 6.11 終止每孔加終止液50l終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。 6.12 測(cè)定以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度OD值。 六、 實(shí)驗(yàn)計(jì)算：1、血清肌酐濃度的計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo))，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；若有稀釋再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。2、尿微量白蛋白濃度的計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃

13、度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。3、 腎臟系數(shù)的計(jì)算：腎臟系數(shù)=腎臟重量（g）/體重（g）100%七、 預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)所得染毒前后體重差、小鼠腎臟系數(shù)、血清肌酐含量、尿蛋白含量，按照方差分析法，預(yù)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組之間及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），尚不能證明鎘對(duì)腎臟組織有損傷作用。八、 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與結(jié)論：建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù)，分別輸入各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。表1 小鼠染毒前后體重差 CdCl2（mg/kg） 0.9%生理鹽水 合計(jì)編號(hào) 0.050 0.100 0.200 123 45678910排除異常值之后小鼠數(shù)

14、量平均值標(biāo)準(zhǔn)差方差方差分析1變異來(lái)源 SS df MS F P總變異組間組內(nèi)按照方差分析法，算出各實(shí)驗(yàn)組之間及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2 五種方案處理后小鼠腎臟系數(shù) CdCl2（mg/kg） 0.9%生理鹽水 編號(hào) 0.050 0.100 0.200 123 45678910方差分析2變異來(lái)源 SS df MS F P總變異組間組內(nèi)按照方差分析法，算出各實(shí)驗(yàn)組之間及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表3 五種方案處理后小鼠血清肌酐含量（mg/ml） CdCl2（mg/kg） 0.9%生理鹽水 合計(jì)編號(hào) 0.050 0.100 0.200 123 45678910排除異常值之后小鼠數(shù)量平均值標(biāo)準(zhǔn)差方差方差分析3變異來(lái)源 SS df MS F P總變異組間組內(nèi)按照方差分析法，算出各實(shí)驗(yàn)組之間及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表4 五種方案處理后小鼠尿微量白蛋白含量（ug/ml） CdCl2（mg/kg