1、第二章 免疫組織化學(xué)的基本理論與技術(shù),一、免疫組織化學(xué)的基本理論 1 原理：免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry) 是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。 可在光鏡和電鏡水平觀察細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)某種抗原物質(zhì)的存在，從而為研究生命大分子，特別是酶、蛋白質(zhì)、激素及受體蛋白等在組織內(nèi)分布、細(xì)胞內(nèi)定位以及代謝狀態(tài)等，提供了特異性強(qiáng)、靈敏度高而又直觀化的原位分析細(xì)胞組成物質(zhì)的手段。,2 免疫組織化學(xué)全過(guò)程包括: 抗原提取 抗體制備 (博士德,華美,基因公司等購(gòu)買(mǎi))

2、抗體標(biāo)記 免疫染色 觀察分析等過(guò)程,二、抗原與抗體,1.抗原 Ag 定義：是指能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并與相應(yīng)的免疫產(chǎn)物（抗體）發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。 蛋白質(zhì)：免疫原性最強(qiáng)； 多糖：免疫原性次之； 脂類和核酸：必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。,2.抗體 Ab 定義：是機(jī)體受到抗原刺激后，由免疫細(xì)胞合成并分泌出 一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白。 存在部位：主要存在于血清內(nèi)。 分類：根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種， 即IgG、 IgD、IgE、IgA、IgM。 根據(jù)制備方法不同分為兩種 即單克隆抗體與多克隆抗體,IgG的結(jié)構(gòu),IgG分子呈“Y”型由兩條L鏈和兩條H鏈

3、組成。用木瓜酶水解IgG可得到3個(gè)片段：兩個(gè)相同F(xiàn)ab段或抗原結(jié)合段和另一Fc段或可結(jié)晶段。在Fab段與Fc段之間有一個(gè)對(duì)酶敏感的區(qū)域，稱鉸鏈區(qū)。,多克隆抗體,制備原理： 將純化的抗原注射入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，一系列抗體生成細(xì)胞會(huì)不同程度的與抗原結(jié)合，受抗原刺激后在血液中產(chǎn)生不同類型的抗體，這種由一種抗原刺激產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體。,單克隆抗體,Ag,合成抗體,效應(yīng)性B 細(xì)胞 (漿細(xì)胞),不能在體外生長(zhǎng),瑞士Kohler,英國(guó)Milstein,多發(fā)性骨 髓瘤細(xì)胞,多發(fā)性骨 髓瘤細(xì)胞,不能合成抗體,能在體外大量繁殖,脾,多發(fā)性骨 髓瘤細(xì)胞,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,A

4、b,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,一抗,單克隆抗體,多克隆抗體,缺點(diǎn):價(jià)格較高，容易出現(xiàn)假陰性反應(yīng)。,實(shí)質(zhì):是受同一種抗原刺激，由多個(gè)B淋 巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。,優(yōu)點(diǎn):容易制備，價(jià)格便宜,缺點(diǎn):可能與多種特異性和非特異性的抗原決定簇反應(yīng)，出現(xiàn)非特異性染色，影響結(jié)果的判定。,實(shí)質(zhì):是受同一種抗原刺激，由單個(gè)B淋 巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體。,優(yōu)點(diǎn):特異性強(qiáng)，敏感性高，抗體產(chǎn)量高。,首選,三、免疫組織化學(xué)的基本技術(shù),免疫組織化學(xué)技術(shù)是用標(biāo)記物或顯色物標(biāo)記的抗原(或抗體)檢測(cè)組織和細(xì)胞內(nèi)的抗原，從而達(dá)到診斷或研究的目的。特定抗原(或抗體)的顯示和定位是否準(zhǔn)確與細(xì)胞和組織標(biāo)本制各的質(zhì)量好壞有著密

5、切關(guān)系。因此，組織和細(xì)胞標(biāo)本的取材和制備至關(guān)重要。,1.組織標(biāo)本制備 （1）標(biāo)本新鮮：一般在2h以內(nèi)進(jìn)行。 （2）取材部位：取含待檢抗原部位，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即抗原陽(yáng)性和陰性區(qū)，必要時(shí)取遠(yuǎn)離病變區(qū)的正常組織作為對(duì)照。對(duì)于只研究正常組織抗原，取材時(shí)應(yīng)盡可能避開(kāi)壞死區(qū)。 （3）避免擠壓：剪刀、刀片的刃口要鋒利。 （4）取材大?。鹤鍪炃衅慕M織厚度不宜超過(guò)2mm，用作冰凍切片的以4mm為宜。 （5）固定:化學(xué)固定,或于液氮中,或70冰箱中保存。,2細(xì)胞標(biāo)本制備,(1)印片法 應(yīng)用：活檢標(biāo)本、手術(shù)切除的標(biāo)本。 方法：將新鮮標(biāo)本暴露病區(qū),用載玻片輕壓病區(qū)，脫落細(xì)胞粘附于載玻片上，立即浸入固定液

6、中5-10min，取出后自然干燥，低溫保存。 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便省時(shí)，細(xì)胞抗原保存較好。 缺點(diǎn)：細(xì)胞分布不均、重疊,影響觀察效果,(2) 穿刺吸取涂片法 應(yīng)用：實(shí)質(zhì)器官的病變區(qū)。 方法：穿刺液較少時(shí)直接涂片,力求均勻。 穿刺液較多時(shí)，穿刺液滴入2毫升 Hanks液內(nèi)，離心，制成細(xì)胞懸 液，吸一滴于載玻片上，輕涂， 干燥后固定。 優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞均勻。 缺點(diǎn)：細(xì)胞易變形。,(3)體液沉淀涂片法 1) 細(xì)胞數(shù)較多，取一滴直接涂片。 2) 細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，取5毫升自然沉淀液以1500rpm離心10min，棄上清，將沉淀涂片，略干后固定備用。,（4）體外培養(yǎng)細(xì)胞 1)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞：將蓋玻片插入培養(yǎng)液中，讓細(xì)胞自然貼

7、壁于蓋玻片上。 2)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞：可用離心涂片機(jī)法制成涂片。 （5）離心涂片機(jī)法 制成2105-6ml細(xì)胞懸液,取50100l，加入涂片機(jī)內(nèi)，1000rmin, 2min，細(xì)胞即可均勻分布于載玻片上。,（二）免疫組織化學(xué)的固定方法,免疫組織化學(xué)固定的原則： 最好地保存細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和最大限度地保存抗原的免疫活性。 方法： 一）固定有物理固定，如血涂片可采用空 氣快速干燥、凍結(jié)干燥等； 二）化學(xué)固定,1浸入法： 組織立即浸于固定液內(nèi),時(shí)間在212h之間。 2灌注法： 插管由左心室插入主動(dòng)脈,先用PBS沖洗血液,再 以泵或吊瓶灌注固定液。在灌注后30min內(nèi)取材, 再置同一固定液內(nèi)浸入固定

8、l3h?？墒构潭ㄒ?到達(dá)全身各處組織。 3微波固定： 微波處理后,溫度升高,分子運(yùn)動(dòng)加快,促進(jìn)固定 液向組織內(nèi)滲透,短時(shí)間達(dá)到固定效果。將標(biāo)本 放入510ml固定液內(nèi),置于爐中央,周邊放一燒 杯盛400純水以吸收爐內(nèi)產(chǎn)生的熱量,選擇強(qiáng)檔照 射1030s,照后固定液溫度50。取出后,在 相同固定液內(nèi)再固定26h(室溫)。,（三）重要固定液,(1) 醛類固定劑: 為雙功能交聯(lián)劑, 可使組織間相互交聯(lián)，將抗原保存于原位。特點(diǎn)是對(duì)組織的穿透性強(qiáng)，收縮性小.是常用固定劑。 1) 10中性緩沖福爾馬林：該固定劑易使組織硬化而致浸蠟困難，因此固定時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。 2) 4多聚甲醛磷酸緩沖液：適應(yīng)性較廣泛，因較

9、溫和，適于組織標(biāo)本的較長(zhǎng)時(shí)期的保存。 3) Bouins液：對(duì)組織固定力強(qiáng)且較均勻。比單獨(dú)醛類固定更適和免疫組化染色，較常用，通常4下固定68h。 4) Zamboni液：用于光、電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)觀察。,(2) 非醛類固定劑： 為非醛類雙功能試劑，單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，邊緣固定效應(yīng)較重，但與戊二醛或多聚甲醛混合使用時(shí)，效果明顯好轉(zhuǎn)。較適用于多肽類激素的組織固定。 1) 碳化二亞胺液: 適用于含多肽激素組織的固定。 2) 碳二亞酰胺一戊二醛液(ECDG液)：對(duì)酶等蛋白質(zhì)固定效果良好，對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原定位，超微結(jié)構(gòu)保存好，是培養(yǎng)細(xì)胞電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)的良好固定劑，也常用于多肽類激素固定。 3) Zenkers液：

10、因含重金屬，固定時(shí)間要短，以24h為宜。染色前必須脫汞。,(3) 丙酮及醇類固定劑： 其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，對(duì)組織穿透性很強(qiáng)，能夠較好地保存抗原的免疫活性。但醇類對(duì)低分子蛋白、多肽及胞漿蛋白質(zhì)的保存效果較差。與冰醋酸、氯仿、甲醛等混合使用，效果可明顯改善。 1) 丙酮：常用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的后固定。保存抗原性較好，穿透性及脫水性較強(qiáng)。 2) 95%乙醇：用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的后固定。效果較差,和其他試劑混合使用,染色較好。 3) AAF液：較常用的固定液。(95100乙醇85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10m1)。 4) Carnoy液：100乙醇醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml

11、，混合后4保存?zhèn)溆谩?3固定劑的選擇 固定劑的種類很多，至今尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的固定劑，10中性甲醛是國(guó)際最通用的固定劑。需指出，同一固定液固定的組織，染色結(jié)果可截然不同；不同的抗原和不同的組織標(biāo)本往往需反復(fù)試驗(yàn)，必要時(shí)可做多種固定液對(duì)比，才能選出最佳的固定液。,(四) 組織包埋和切片技術(shù),固定的和未經(jīng)固定的組織、細(xì)胞以及各種涂片和切片方法均可用于免疫組化，但其效果不同。光鏡免疫組織化學(xué)的切片厚度一般為46m，而神經(jīng)組織切片通常為20100m厚，以便顯示神經(jīng)纖維的走行。,1冰凍切片 冰凍切片(frozen section)是酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。 優(yōu)點(diǎn)：1）能較好地保持

12、抗原活性(尤其是表面 抗原)和酶的活性。 2）冰凍切片簡(jiǎn)便快速，省去固定、包埋 和切片處理等一系列繁瑣步驟。 適用范圍：新鮮的組織及已固定的組織均可作 冰凍切片。 缺點(diǎn)：1）不能用于回顧性研究。 2）不利于常規(guī)檢查和長(zhǎng)期保存標(biāo)本。 3）不如石蠟切片結(jié)構(gòu)清晰。,（1）冷凍、包埋 為防止冷凍中形成冰晶破壞組織結(jié)構(gòu)和保持抗原，采取： 1) 浸入深低溫預(yù)冷的（干冰容器內(nèi)，-70)正已烷液內(nèi)驟冷3060秒，或用OCT包埋劑浸透，使組織速凍，溫度驟降，減少冰晶的形成。方法：干冰-丙酮法： 液氮法： 2) 將固定后或未固定的組織置于20-30蔗糖溶液l3天。利用高滲吸收中水份;減少組織含水量。包埋、冷凍步驟

13、同上。,(2) 切片 技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機(jī)是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。 1) 恒冷箱切片機(jī)(cryostat)常用、理想的切片機(jī)： 切片機(jī)置于-30低溫密閉室內(nèi)，可連續(xù)切薄片切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15-18為宜，溫度過(guò)低組織易破碎。 2) 開(kāi)放式冰凍切片機(jī)：切片時(shí)暴露空氣中，切片技術(shù)難度大。在高溫季節(jié)，切片更加困難，目前處于淘汰階段。,(3) 冰凍切片的保存使用 如不染色，必須室溫下吹干30min以上，裝入密封的標(biāo)本盒內(nèi)，外包塑料袋，置于-20低溫冰箱，一個(gè)月內(nèi)使用。 染色前，從冰箱內(nèi)取出切片，置室溫干燥10min，再經(jīng)丙酮固定510min(未固定者)，即可進(jìn)入染色程序。,2. 石蠟切

14、片 石蠟切片(paraffin secfion)：指在切片前，固定的組織塊需經(jīng)乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，再浸蠟包埋。 組織在浸蠟、包埋時(shí)，石蠟溫度應(yīng)低于60，各步驟時(shí)間均不宜過(guò)長(zhǎng)(12h)，以免組織變脆。 切片一般厚約35m，切片于37烘烤過(guò)夜，可置4保存，脫水、透明也可在4進(jìn)行。（詳見(jiàn)組織學(xué)與胚胎學(xué)第六版）,3振動(dòng)切片 振動(dòng)切片是將新鮮組織(不固定不冷凍，或低濃度固定液稍稍固定)后用振動(dòng)切片機(jī)切成20100m厚，漂浮免疫組化染色，檢出陽(yáng)性部位，后固定，常規(guī)電鏡樣品制備。適于免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)觀察。,4 塑料包埋切片(plastic section) 常用的包埋材料有兩大類：甲基丙烯酸鹽類和環(huán)氧

15、樹(shù)脂類。 前者能較好地保存抗原，不與組織產(chǎn)生共聚合，染色前不必脫去包埋材料，但形態(tài)結(jié)構(gòu)欠佳，切片易皺折； 后者能較好地保持形態(tài)結(jié)構(gòu)，但在聚合過(guò)程中易與組織作用，改變抗原結(jié)構(gòu)。 優(yōu)點(diǎn)：組織塊可同時(shí)用于一般光鏡切片、半薄切片(0.51.5m)和電鏡超薄切片。 缺點(diǎn)：所經(jīng)步驟繁瑣，抗原活性易喪失。 應(yīng)用范圍：塑料包埋切片主要用于免疫電鏡超薄切片前定位。,5. 超薄切片 超薄切片(ultrathin section)適用于免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)，需用超薄切片機(jī)(詳見(jiàn)有關(guān)電鏡技術(shù)資料)。 6載玻片及蓋玻片的處理和切片的附貼 (1)載玻片及蓋玻片的處理 1)載玻片：清洗液(酸)浸泡12-24h，水洗，95乙醇浸

16、泡2h后擦干或烤干。 2)蓋玻片：清洗液浸泡2h，或鹽酸乙醇浸泡后水洗，95乙醇浸泡，擦干。,(2) 切片的附貼 為防止染色過(guò)程脫片，適用免疫組化染色中的附貼劑： 1)甘油明膠； 2)甲醛一明膠； 3）鉻明礬-明膠； 4）多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)； 5）APES； 6）APES和Poly-L-lysine聯(lián)合應(yīng)用：適于特別容易脫片的情況。,（五）免疫組織化學(xué)的染色方法及注意事項(xiàng),一）免疫組織化學(xué)染色方法 1.按標(biāo)記物種類分為： 免疫酶法； 免疫金一銀法； 鐵標(biāo)記法； 免疫熒光法； 雙重或多重免疫染色法等。,2. 按標(biāo)記抗體不同分為: （1）直接法： 抗原 + 一抗（標(biāo)記物標(biāo)記）

17、 鏡下觀察 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，時(shí)間短，特異性強(qiáng)。 缺點(diǎn)：靈敏度差，所需抗體量大，不經(jīng)濟(jì)，淘汰。,（2） 間接法：經(jīng)過(guò)二次抗體 抗原 + 一抗 + 二抗（標(biāo)記物標(biāo)記） 特點(diǎn)：較直接法靈敏，可標(biāo)記一種抗體鑒定多種抗原。,（3） 非標(biāo)記抗體橋法（橋連法、多步法） 經(jīng)過(guò)三次抗體 特點(diǎn)：任何抗體均未被酶標(biāo)記； 酶是與抗酶 抗體結(jié)合，避免因共價(jià)結(jié)合對(duì)抗體和酶活性的影響，提高敏感性，節(jié)約一抗用量。 抗標(biāo)記物抗體（用與一抗同種動(dòng)物產(chǎn)生） 抗標(biāo)記物抗體 + 標(biāo)記物 = 免疫復(fù)合物(如PAP，APAAP), 抗原 + 一抗 + 二抗 + 三抗 （PAP，APAAP）,1）單橋法 抗原 + 一抗 + 二抗（橋抗體）+ 三

18、抗（抗酶抗體） 底物顯色,2） 雙橋法 在三抗之后，將二抗和三抗再重復(fù)一次，可增大染色強(qiáng)度。 特別提示：注意動(dòng)物種屬關(guān)系的一致性。 （4）葡萄球菌A蛋白法 （5）ABC法、SABC、Envision,2 免疫組化染色基本技術(shù),（1）抗體稀釋度 1）工作液- 2） 原液- 預(yù)實(shí)驗(yàn) 3） 抗體濃度選擇- 控制一定濃度范圍 （2）抗體滴片技術(shù) （3）PBS洗滌 1）目的- 保證離子濃度、PH、減少非特異反應(yīng) 2）方法,（3）抗體孵育技術(shù) 濕盒、溫度、時(shí)間,二）免疫組化染色注意事項(xiàng)： pH： 中性及弱堿性 反應(yīng)液和洗滌液： pH 7.2-7.4緩沖液配制 離子濃度： 低離子濃度： 0.01-0.02m

19、olL緩沖液 去污劑： 0.05Tween20 0.01% EDTA 0.1-lTriton X-100 可分別加入反應(yīng)液和染色前洗滌液內(nèi), 抗體稀釋液中蛋白質(zhì)濃度： 減少抗體的非特異性吸附 0.1-0.6牛血清白蛋白(BSA) 5-10正常山羊血清 防腐劑： NaN3(0.0l)-抑制非特異性著色、提高靈敏性 溫度和時(shí)間： 濕度 洗滌： 可除去前一步所加的未結(jié)合抗原或抗體，以消除因非特異性染色。 洗滌液中可加入去污劑 振蕩,（六）對(duì)照,目的：證明和肯定陽(yáng)性結(jié)果的特異性。 主要是針對(duì)第一抗體對(duì)照，常用的對(duì)照方法包括： 陽(yáng)性對(duì)照； 陰性對(duì)照； 阻斷試驗(yàn)； 替代對(duì)照； 空白對(duì)照； 自身對(duì)照； 吸收

20、試驗(yàn)。,(一)陽(yáng)性對(duì)照 已知抗原陽(yáng)性的切片-陽(yáng)性對(duì)照 待檢標(biāo)本呈陰性結(jié)果時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照尤為重要。 (二)陰性對(duì)照 不含已知抗原的標(biāo)本-陰性對(duì)照 空白、替代、吸收和抑制試驗(yàn)都屬陰性對(duì)照 待檢標(biāo)本呈陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，陰性對(duì)照就更加重要，用以排除假陽(yáng)性。,準(zhǔn)確判斷陽(yáng)性和陰性,排除假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 多次重復(fù)實(shí)驗(yàn) 幾種方法進(jìn)行驗(yàn)證,（七）免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果的判斷,特異性染色與非特異性染色的鑒別點(diǎn) 特異性染色表現(xiàn)： 常分布于特定的部位, 即具有結(jié)構(gòu)性。 在同一切片上呈現(xiàn)不同程度的陽(yáng)性染色結(jié)果。 非特異性染色表現(xiàn)： 無(wú)一定的分布規(guī)律,常為成片的均勻著色； 細(xì)胞和周?chē)慕Y(jié)締組織均無(wú)區(qū)別的著色,或CT呈現(xiàn)強(qiáng)染； 切片的邊緣、刀痕、組織折疊部位易出現(xiàn)。 非特異性和特異性染色同時(shí)存在： 過(guò)強(qiáng)的非特異性染色背景,1陽(yáng)性細(xì)胞的染色特征 (1)陽(yáng)性細(xì)胞染色分布為灶性和彌漫性，三種類型： 胞漿：大部分抗原見(jiàn)于細(xì)胞漿 細(xì)胞核 細(xì)胞膜表面 (2)細(xì)胞內(nèi)含抗原量不同 染色強(qiáng)度不一 (3）陽(yáng)性細(xì)胞與陰性細(xì)胞相互交雜分布; (4)相同的陽(yáng)性染色強(qiáng)度,不能用于判斷陽(yáng)性。 如：切片邊