1、質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化,1,目 的,鞏固質(zhì)粒的概念，通過原理部分的學(xué)習(xí)加深對(duì)質(zhì)粒DNA與染色體DNA理化性質(zhì)差異的認(rèn)識(shí) 學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法 掌握酶切反應(yīng)的操作,2,質(zhì) 粒 提 取,3,質(zhì)粒是染色體外小型（1-200kb）的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子，能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。 是進(jìn)行DNA重組的常用載體。 常常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基因的表型主要為抗生素抗性。,質(zhì) 粒,4,Ampr抗性基因,Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割A(yù)mp的-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力,5,常 用 質(zhì) 粒 提 取 方 法,煮沸法 對(duì)大腸桿菌可從固體培

2、養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)粒DNA中會(huì)含有RNA。 堿裂解法,6,堿裂解法提取原理,宿主菌線狀染色體DNA與閉環(huán)雙鏈質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)狀態(tài)的差異,加入堿變性時(shí)，線狀基因組DNA變性充分而質(zhì)粒DNA處于拓?fù)淅p繞的自然狀態(tài)而不能彼此分開,當(dāng)條件恢復(fù)時(shí)（酸中和），質(zhì)粒DNA迅速準(zhǔn)確配置重新形成完全天然超螺旋分子。,由于操作原因，提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。,7,收菌 重懸 裂解 中和 過柱 洗滌 洗脫,質(zhì)粒提取試劑盒操作步驟,P1: 50mM葡萄糖，25mMTris-HCl, 10mM EDTA pH8.0 P2: 0.2MNaOH,1%SDS P3:

3、 3M醋酸鉀, 2M醋酸,硅基質(zhì)膜在高鹽低pH值（pH7.5）時(shí)可結(jié)合DNA，在低鹽及高pH值（pH8）條件下洗脫。,75%乙醇,對(duì)數(shù)生長后期,8,取菌液 12,000rpm離心2min 棄上清（盡可能吸盡上清）,用250uLPI重懸菌體沉淀，漩渦振蕩至徹底懸浮,加入250uLP2，溫和地上下顛倒6 -10次 (溶液粘稠清亮),加入350uLN3, 立即溫和上下翻轉(zhuǎn)6 -10次（白色絮狀沉淀） 12,000rpm離心10min,小心吸取上清，加入吸附柱 12,000rpm離心1min 棄濾液,加入700uL buffer PW 12,000rpm 離心1min， 棄濾液,空柱12,000rpm

4、 離心2min， 室溫開蓋放置3 5 min,加入500uL buffer PW 12,000rpm 離心1min， 棄濾液,吸附柱置于新離心管中，加入50-100uLbuffer EB, 室溫放置2min，12,000rpm離心1min，收集質(zhì)粒溶液到離心管，-20 保存。,CWBIO,9,取菌液 12,000rpm離心2min 棄上清（盡可能吸盡上清）,用250uLPI重懸菌體沉淀，漩渦振蕩至徹底懸浮,加入250uLP2，溫和地上下顛倒6 -10次 (溶液粘稠清亮),加入350uLP3, 立即溫和上下翻轉(zhuǎn)6 -10次（白色絮狀沉淀） 12,000rpm離心10min,小心吸取裂解上清，加入吸附柱 12,000rpm離心1min 棄濾液,加入500uL buffer PD 12,000rpm 離心1min， 棄濾液,空柱12,000rpm 離心2min， 室溫開蓋放置3 5 min,加入600uL buffer PW 12,000rpm 離心1min， 棄濾液 （重復(fù)一次）,吸附柱置于新離心管中，加入50-100uL洗脫液 EB, 室溫放置2min，12,000rpm離心1min，收集質(zhì)粒溶液到離心管，-20 保存。,T&G,（500u