1、PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置,山東省疾控細(xì)菌所 2013-11-19,張華寧,PFGE 基本原理 參數(shù)設(shè)置 實驗流程 細(xì)菌分型原理 PFGE需配備的相關(guān)儀器 PFGE所需耗材清單,通常的瓊脂糖凝膠電泳利用雙鏈DNA 分子在電場作用下，在凝膠中的遷移率不同而達(dá)到分離的目的。 當(dāng)雙鏈DNA 分子超過一定的大小以后，DNA 雙螺旋的半徑超過了凝膠的孔徑，在瓊脂糖中的電泳速度會達(dá)到極限，我們稱之為“極限遷移率”，此時凝膠不能按照分子大小來篩分 DNA。,有實驗證明，長度超過40KB的DNA分子不能在恒強(qiáng)水平瓊脂糖凝膠電泳中分離,與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，這項技術(shù)采用定時改變電場方向的交變

2、電源，每次電流方向改變后可持續(xù) 1s 到 5min 左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以將其稱之為脈沖式交變電場。目前PFGE裝置有垂直脈沖場、電場翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)、鉗位勻強(qiáng)電場（CHEF)等電泳系統(tǒng)。,PFGE方法用來研究細(xì)菌的分子流行病學(xué)特點，能夠?qū)θ蚪M進(jìn)行 分析，最終分析的DNA超過90%，可以從整個基因組的角度考慮菌株 間的關(guān)系。 用稀有位點的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切可以獲得菌種某亞種特有的電泳 圖譜，是PFGE技術(shù)的顯著優(yōu)勢。 靈敏、分型能力強(qiáng)：電場是不斷改變的，有利于DNA的遷移 重復(fù)性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定、易于標(biāo)準(zhǔn)化?！敖饦?biāo)準(zhǔn)” 相同的操作框架適用于多種菌，只需選擇合適內(nèi)切酶、優(yōu)

3、化電泳條件 即可。,參數(shù)設(shè)置,脈沖時間 電場夾角 電場強(qiáng)度 電泳溫度 緩沖液組成 瓊脂糖類型和濃度,脈沖時間是指電場在某個角度持續(xù)的時間。 脈沖場電泳的核心參數(shù)。通常實驗中使用的脈沖時間為一個范圍值，如：220S。 脈沖時間的變換可以是線性的或者是非線性的。 與電泳時間作區(qū)別，電泳時間通常為20hr左右，其根據(jù)是標(biāo)準(zhǔn)菌種H9812的20Kb片段距膠的下緣為1-1.5cm.,脈沖時間,脈沖時間不同脈沖時間對帶型的影響,隨著脈沖時間上限的縮短大片段DNA的位置越來越靠近上端加樣孔，同時小片段也得到了充分的分離。,隨著電場夾角的減小，兩個大片段DNA分離的更好。但同時小片段也在逐漸的壓縮。所以為了兼

4、顧不同大小的片段需要選擇一個合適的電場角度。,使用較小的電場夾角可以分離較大的DNA片段，反之較大的電場夾角用來分離較小的片段。當(dāng)使用較小的電場夾角時，小片段會變的相對集中。,大部分基于CHEF脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)的操作手冊使用的電場夾角為120,電場強(qiáng)度,A.電場強(qiáng)度以V/cm來表示的。 B.大部分基于CHEF脈沖場凝膠 電泳系統(tǒng)的操作手冊使用的電 場強(qiáng)度為6V/cm。 C.使用較高的電場強(qiáng)度可以分離 較大的DNA片段，反之亦然。,電泳溫度,通過冷凝以及循環(huán)系統(tǒng)實現(xiàn)對電泳緩沖液的溫度控制。 B. 較高的溫度會造成條帶彌散，影響分辨率。 C. 通常使用的緩沖液的溫度為1215。標(biāo)準(zhǔn)化溫度定為14

5、.,緩沖液類型,緩沖液選擇：緩沖液的緩沖能力以及長時間電泳后液體的損耗問題。 通常緩沖液包括兩種0.5XTBE和1XTAE，其中1XTAE常用于MB級DNA片斷的分離（3MB），而0.5XTBE常用于1MB的片斷的分離。,0.5X TBE,1.0X TAE,瓊脂的種類以及瓊脂的濃度,使用的瓊脂糖濃度越低，所能分離的DNA片段越大。但瓊脂濃度低時其機(jī)械強(qiáng)度也低，實驗操作難度也難免會加大。 使用的瓊脂糖應(yīng)當(dāng)具備以下的特點： 1、機(jī)械強(qiáng)度大，利于實驗操作 2、純度高，可提高電泳的分辨率 3、熔點低，包埋細(xì)菌時凝膠的溫度不易過高 標(biāo)準(zhǔn)化操作中使用SeaKem Gold(SKG)瓊脂糖,方法標(biāo)準(zhǔn)化,實驗

6、流程,細(xì)菌 培養(yǎng),菌體 裂解,膠塊 洗滌,DNA 酶切,加樣 電泳,結(jié)果 處理,細(xì)菌 培養(yǎng),制備 膠塊,第一天,第二天,第三天,膠塊的制備：用瓊脂糖將細(xì)菌包埋，避免染色體DNA的機(jī)械性損傷。,實驗流程,細(xì)菌的裂解：蛋白酶K水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白。,實驗流程,膠塊中DNA的酶切： 寡切點酶片段少而大 片段數(shù)目（ 10， 2530）,酶切片段的電泳,實驗流程,圖像的獲?。篋NA指紋圖譜 EtBr或GelRed染色,BioNumerics 軟件作聚類分析,在使用細(xì)菌分型的結(jié)果進(jìn)行暴發(fā)研究時是基于以下幾個假設(shè)的： 1. 屬于一次暴發(fā)的分離株來源于同一個祖先 2. 這些菌株應(yīng)該具有相

7、同的基因型 3. 流行病學(xué)無關(guān)的菌株應(yīng)該有不同的基因型別,細(xì)菌分型原理,菌株分型的目的是為了提供實驗室角度的證據(jù)。這一證據(jù)支持那些分離自一次暴發(fā)中分離的流行相關(guān)（epidemiologically related）菌株，同時也是遺傳相關(guān)的（genetically related）菌株，從而證明這些菌株是同樣的菌株。,基因事件與條帶變化,獲得 失去 插入 缺失,無法區(qū)分：分離株有相同的帶型，包括條帶的數(shù)目和位置。這些分離株為同 一菌株。 高度相關(guān)：如果PFGE帶型僅有因一次基因事件引起的帶型變化，這些菌株 就被定義為高度相關(guān)菌株。這些僅有兩到三個條帶變化的情況常 見于反復(fù)傳代以及從同一病人中多次

8、分離的菌株。 可能相關(guān)：PFGE帶型與暴發(fā)菌株帶型變化有兩個獨(dú)立的基因事件引起的條 帶變化（通常是4到6個條帶的變化）。這些分離株可能是遺傳 上相關(guān)的，但是并不是緊密相關(guān)的，其流行病學(xué)關(guān)系也并不緊密。 這樣的突變常見于分離自較長的時間段（大于等于6個月）或者 是大規(guī)模延伸暴發(fā)的病人中。 無 關(guān)：三個獨(dú)立的基因事件引起的條帶變化（7個或者是以上的條帶變化）。,TENOVER原則,TENOVER原則的聚類方法,首先，檢查所有的帶型，確定能否發(fā)現(xiàn)一個暴發(fā)帶型或者代表帶型。如果沒有發(fā)現(xiàn)代表帶型，那么這些分離株很可能是流行病學(xué)無關(guān)菌株。（流行相關(guān)的菌株中沒有代表帶型的情況是小概率事件）。 其次，以暴發(fā)帶

9、型為基礎(chǔ)和其他分離株的帶型進(jìn)行比較。應(yīng)該確定每個帶型與暴發(fā)帶型的關(guān)系。帶型差異超過50%的分離株可以認(rèn)為是暴發(fā)無關(guān)分離株。而那些與暴發(fā)帶型只有2到3個條帶差異的分離株被認(rèn)為是暴發(fā)帶型的衍生。,聚類分析,菌株分型研究不能代替流行病學(xué)研究，要將流行病學(xué)資料分析研究應(yīng)作為基礎(chǔ)。 兩項工作雖分別進(jìn)行，但是要綜合在一起進(jìn)行分析才能確定是否真正存在著暴發(fā)。 PFGE作為暴發(fā)菌株的鑒定是一種有效的方法，然而一旦收集菌株的時間跨度超過三到六個月，分型研究就轉(zhuǎn)化為種群研究。 另外一些技術(shù)，如MLST，主要用于監(jiān)測微生物種群隨時間變化的特點。管家基因的突變是中性突變，不受環(huán)境選擇壓力的影響。近來，這兩種方法經(jīng)常被結(jié)合起