1、多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群,考查內容： 一、預習報告（包括提問） 二、操作（無菌操作，隨機抽看） 三、實驗報告,實驗十一(綜合實驗）,多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群,一、實驗目的 二、實驗原理 三、實驗材料 四、實驗步驟 五、實驗報告,一、實驗目的,1、學習測定水中大腸菌群數量的多管發(fā)酵法。 2、了解大腸菌群的數量在飲水中的重要性。,發(fā)酵法： 又稱多管發(fā)酵法或三步發(fā)酵法 1) 初發(fā)酵（推測試驗）： 將不同稀釋度的水樣，分別接種于含有乳糖等糖類的培養(yǎng)液中（3倍或1倍乳糖液），經37 C培養(yǎng)24 h，觀察產酸產氣情況，培養(yǎng)基內加有溴甲酚紫作為PH指示劑，細菌產酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色，以初步

2、判斷是否有大腸菌群存在。,二、實驗原理,2）平皿分離（證實試驗）,水中除大腸菌群外，尚有其它細菌可能引起糖類發(fā)酵，因此需要進一步證實。 將初發(fā)酵管中已發(fā)酵的菌液接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基，37 C培養(yǎng)24 h，根據菌落特征（帶核心的、有金屬光澤的深紫色菌落），挑取可能為大腸菌群的菌落制片，經革蘭氏染色，進一步證實是否為大腸菌群。,3） 復發(fā)酵試驗(完成實驗）,將上述可能為大腸菌群的菌落再次轉接入1倍乳糖培養(yǎng)液中，經37 C培養(yǎng)24 h，產酸產氣者即最后確證為存在大腸菌群。 產酸、產氣分別記為陽性反應，不產酸、產氣則記為陰性反應； 根據陽性管數量，查表求得水體大腸菌群的數量。,三、實驗材料,1、培養(yǎng)基

3、： 乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（瓶）（內有倒置小套管），伊紅美藍瓊脂平板，滅菌水。 2、儀器或其他用具： 載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管等。,四、操作步驟,1水樣的采取 實驗室提供水樣 2河水的檢查 （1）初（步）發(fā)酵實驗 水樣的稀釋： 10-1與10-2 接種：分別吸取1ml 10-2 、 10-1和原水樣接入裝有10ml普通濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵管 ；另取10ml原水樣接入裝有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管 ，混勻后，37 培養(yǎng)24 h，24 h未產氣的繼續(xù)培養(yǎng)48 h。,（2）平板分離 將經24 h和48 h培養(yǎng)后產酸產氣的發(fā)酵管，分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板上，再于37 培養(yǎng)1824 h，將符合下列特征的菌落進行染色鏡檢。 深紫黑色，有金屬光澤； 紫黑色，不帶或略帶金屬光澤； 淡紫紅色，中心顏色較深。,（3）復發(fā)酵試驗 將鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌的菌株重復初步發(fā)酵試驗。并根據初發(fā)酵管試驗的陽性管查表，即得大腸菌群數。,圖1 多管發(fā)酵測定水中大腸菌群的操作步驟和結果解釋,五、思考題,1.實驗結果報告 河水水樣：陽性結果記“”，陰性結果記“”。 查表6獲得每升水樣中總大腸菌群是多少？ 2.思考題