1、生命科學(xué)學(xué)院,第七章 外源基因的表達(dá)及其優(yōu)化策略,第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素 第二節(jié)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá) 第三節(jié)外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),生命科學(xué)學(xué)院,本章重點掌握內(nèi)容,基因表達(dá)的關(guān)鍵要素及要求 影響外源基因表達(dá)的因素 表達(dá)產(chǎn)物的純化 甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng),生命科學(xué)學(xué)院,第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素,基因表達(dá)： 從DNA分子有序地將其所承載的遺傳信息,通過密碼子和反密碼子系統(tǒng),轉(zhuǎn)變由特定氨基酸順序構(gòu)成的多肽或蛋白質(zhì)分子過程，從而決定生物有機(jī)體遺傳表型。,基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。 基因工程中基因高效表達(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動，即剪切下外源

2、基因片段，拼接到另一個基因表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。,生命科學(xué)學(xué)院,第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素,生命科學(xué)學(xué)院,第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素,基因表達(dá) 遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程中心法則（central dogma）。,生命科學(xué)學(xué)院,第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素,克隆基因的表達(dá) 外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá),外源基因,表達(dá)載體,重組載體,導(dǎo)入宿主細(xì)胞,在宿主細(xì)胞中 表達(dá)出蛋白質(zhì),提取蛋白,宿主細(xì)胞：,原核細(xì)胞或真核細(xì)胞,生命科學(xué)學(xué)院,第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素,生命科學(xué)學(xué)院,第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素,影響外源基因表達(dá)的因素主要有： 閱讀框架 順式作用元件 翻

3、譯過程 表達(dá)體系,生命科學(xué)學(xué)院,第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素,一、閱讀框架對轉(zhuǎn)化基因的影響 什么是閱讀框架(open reading frame, ORF)? 二、順式作用元件對基因表達(dá)的影響 1.對基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控 1)啟動子 2)增強子 3)沉默子,生命科學(xué)學(xué)院,第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素,二、順式作用元件對基因表達(dá)的影響 2.對基因轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控 1)終止子 2)衰減子 3.對DNA結(jié)構(gòu)的影響 1)核基質(zhì)結(jié)合區(qū) 2)絕緣子 3)基因座控制區(qū),生命科學(xué)學(xué)院,第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素,三、翻譯過程對表達(dá)的影響 1.翻譯起始對基因表達(dá)的影響 2.密碼子偏愛性對基因表達(dá)的影響 3.翻譯終

4、止對基因表達(dá)的影響 四、表達(dá)系統(tǒng)對表達(dá)產(chǎn)物的影響,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),外源基因表達(dá)系統(tǒng)由基因表達(dá)載體和相應(yīng)的受體細(xì)胞兩部分組成。,宿主細(xì)胞分為兩大類： 第一類為原核細(xì)胞： 大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等； 第二類為真核細(xì)胞： 酵母、絲狀真菌、哺乳動物細(xì)胞等。,目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母，已建立了許多適合它們的克隆載體和DNA導(dǎo)入方法。許多外源基因已獲得成功表達(dá)。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),用原核生物作宿主。,A dividing E. coli,原核或噬菌體啟動子,MCS,SD序列,終止子,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在

5、原核細(xì)胞中的表達(dá),大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢 全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 真核與原核生物結(jié)構(gòu)上存在差別,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),一、原核生物細(xì)胞表達(dá)的特點 1.原核生物只有一種RNA聚合

6、酶識別原核細(xì)胞的啟動子，催化所有RNA的合成。 2.原核生物的表達(dá)是以操縱子為單位的。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),一、原核生物細(xì)胞表達(dá)的特點 3.原核生物的轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進(jìn)行的。 4.原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。 5.原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物直接控制要慢。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),一、原核生物細(xì)胞表達(dá)的特點 6.在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點上，含有一個翻譯起始密碼子及同16S RNA 3末端堿基互補的序列，

7、即SD序列。 Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一個啟始密碼子和一段同核糖體16SRNA3末端堿基互補的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),二、外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)具備條件 1.通過表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白。 2.外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA。 3.必須利用原核細(xì)胞的強啟動子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)。 4.外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(ORF)。 5.利用宿主

8、菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對宿主菌的毒害。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),原核生物基因表達(dá)載體的組成特征 啟動子 核糖體結(jié)合位點(SD序列) 終止子 選擇標(biāo)記基因 復(fù)制子 原核生物基因表達(dá)的受體系統(tǒng) 大腸桿菌受體系統(tǒng)、芽孢桿菌受體系統(tǒng) 鏈霉菌受體系統(tǒng)、藍(lán)藻受體系統(tǒng),生命科學(xué)學(xué)院,大腸桿菌表達(dá)載體的基本成分,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 1. 啟動子 是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。 （1）啟動子序列 大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致

9、順序（consensus sequence）。,-35 Box 和 -10 Box,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),不同啟動子的consensus sequences,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 1. 啟動子 （1）啟動子序列 -35box：RNA聚合酶 亞基的識別位點 。 5-TTGACA-3 -10box（Pribnow Box）：5-TATAAT-3,TTGACA,TATAAT,轉(zhuǎn)錄起始位點,17bp,5,核糖體結(jié)合位點,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),原核啟動子共有序列的功能,三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 1. 啟動

10、子 （1）啟動子序列,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 1. 啟動子 （2）翻譯的起始位點 a)核糖體結(jié)合位點（ ribosome binding site ,RBS） Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。 S-D序列距離AUG的距離也影響翻譯 b)起始密碼：位于SD序列下游 AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 2.RNA多聚酶 大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA。

11、,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 3. 轉(zhuǎn)錄終止子 在表達(dá)載體克隆位點的下游一般設(shè)計一段轉(zhuǎn)錄終止子。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 3. 轉(zhuǎn)錄終止子 原理： 莖環(huán)結(jié)構(gòu) 反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個減弱了RNA 與DNA的互作 多聚A/U 由于莖環(huán)3段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 3. 轉(zhuǎn)錄終止子,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在

12、原核細(xì)胞中的表達(dá),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 3. 轉(zhuǎn)錄終止子,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 4. 翻譯終止密碼 大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上全部的三個終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。 5. 翻譯增強子（Translation enhancer） 能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)效率的特殊序列。 T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列（簡稱g10-L序列）; 大腸桿菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的區(qū)段,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體,1. 非融合型表達(dá)載體,載體表達(dá)出的外源基因蛋

13、白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。,S-D序列,ATG-外源基因-TAG,優(yōu)點：產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 缺點：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 1. 非融合型表達(dá)載體 pKK223-3 載體： 結(jié)構(gòu)組成： 1）強啟動子: tac（trp-lac） 2）操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。,trp的-35區(qū),lacUV5的-10區(qū),lac操縱基因,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 1. 非融合型表達(dá)載體 pKK223-3 載體： 結(jié)構(gòu)組成： 3）調(diào)節(jié)基因：宿主菌染色體上的乳

14、糖操縱子系統(tǒng)。 如JM105菌。 4）終止子：rrnB的強終止子 S-D序列和插入位點區(qū)：,S-D,插入位點區(qū),Lac I,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 1. 非融合型表達(dá)載體 pKK223-3 載體： 結(jié)構(gòu)組成： 6）載體的其余部分：來自pBR322質(zhì)粒。 7）表達(dá)誘導(dǎo)物：IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）,tac P,Lac O,S-D,插入位點區(qū),rrnB T,宿主lac I,阻遏物,IPTG,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 1. 非融合型表達(dá)載體 pKK223-3 載體：,條件： 必須選擇一個有

15、lacI的宿主菌。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 2. 分泌型表達(dá)載體 載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。,如：pIN III系列：,pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 2. 分泌型表達(dá)載體 pIN III系列 組成結(jié)構(gòu) 1）強啟動子：Ipp（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。 2）調(diào)節(jié)基因：lac I 。 3）S-D序列和起始密碼ATG。 4）分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白

16、基因ompa。 5）插入位點區(qū)（多克隆位點）。,Ipp,lac P,lac O,S-D/ATG,ompa,插入位點,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),pIN III-comA1,四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 2. 分泌型表達(dá)載體,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng) 表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。 如：pGEX系列 優(yōu)點：便于融合蛋白的分離和純化。 組成結(jié)構(gòu)： 1）啟動子：tac 2）操縱基因：lacP 3）調(diào)節(jié)基因：lacI 4）S-D序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽

17、：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng) pGEX系列,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位點,TGA,lacP,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose親和層析柱分離純化。,產(chǎn)物提純:,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng) pGEX系列 產(chǎn)物分離:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),pGEX-2X的插入?yún)^(qū),pGEX-1X的插入?yún)^(qū),p

18、GEX-3X的插入?yún)^(qū),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng),pGEX系列插入?yún)^(qū),生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 4.其他融合蛋白系統(tǒng) His-tag（組氨酸標(biāo)簽） 在外源多肽的N端或C端接上6個組氨酸（His）。 His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),五、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式,位于,細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞周質(zhì),細(xì)胞外,表達(dá)產(chǎn)物,形式,包涵體蛋白,融合蛋白,整合型外源蛋白,分泌型外源蛋白,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表

19、達(dá),細(xì)胞質(zhì)中表達(dá): 外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時，常會 發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體。 包涵體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚 集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),蛋白質(zhì)的合成是在細(xì)胞之中進(jìn)行的 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點是： 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單； 能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，一般可以達(dá)到占細(xì)胞總 蛋白的20%40%。 目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有二種： 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒 包涵體存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 可溶性的目標(biāo)蛋白質(zhì)除可存在于細(xì)胞質(zhì)中外，還可借助于 本身的功能序

20、列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運輸體系，最終分 泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),周質(zhì)中表達(dá)： 周質(zhì)：在大腸桿菌一類革蘭氏陰性菌中，位于內(nèi) 膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。 在周質(zhì)中表達(dá)的蛋白，需要信號肽序列才能從細(xì) 胞質(zhì)中穿過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),胞外表達(dá)： 使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)， 分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化。,途徑： 1. 用大腸桿菌細(xì)胞固有的途徑，使真正屬于分 泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特 別有效的程序） 2. 誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏， 導(dǎo)致胞內(nèi)的

21、蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。 （可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),五、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 1.包涵體蛋白 本質(zhì)：細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集 包括：1.折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用； 2.非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用； 3.蛋白質(zhì)的中間體結(jié)構(gòu)。 優(yōu)點：易于分離純化,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),包涵體及其性質(zhì) 在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。 包涵體基本由蛋白質(zhì)組成，其中大部分是

22、外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有正確的AA序列，但空間構(gòu)想往往是錯誤的，因而沒有活性，此外，它還含有受體細(xì)胞本身高效表達(dá)的蛋白產(chǎn)物（如RNA聚合酶、外膜蛋白等），以及質(zhì)粒的編碼蛋白，其第三種組分是DNA、RNA、脂多糖等非蛋白分子。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點 在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集 簡化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌 體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì) 菌裂解物中分離出來 能夠表達(dá)對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)

23、蛋白 。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),包涵體表達(dá)形式的缺點 以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過 有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生 物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標(biāo)產(chǎn)物的收 率至關(guān)重要。 經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性， 有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys 殘基數(shù)目較高時，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^ 30% 復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),形成包涵體的原因： 缺少真核生物中翻譯后修

24、飾所需的酶，使中間體大量積累。 缺乏蛋白質(zhì)折疊過程中需要的某些酶和輔因子，或環(huán)境不適無法 形成正確的次級鍵。 表達(dá)水平（重組異源蛋白過量表達(dá)）。 細(xì)菌的遺傳性狀。 異源蛋白氨基酸序列（含硫氨基酸越多越容易）。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),減少形成包涵體的策略： 降低重組菌的生長溫度 添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑（高濃度多醇類、蔗糖） 供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)基（供氧、pH等）,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),包涵體的分離： 菌體破碎（高壓勻漿、高速碾磨、低溫反復(fù)凍融等） 離心收集（高速離心） 清洗（去污劑和低濃度變性劑洗滌以除去脂類和

25、膜蛋白）,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。在 人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。 能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清 洗 劑 SDS、正十二醇肌氨酸 促 溶 劑 鹽酸胍、尿素 混 合 溶 劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用， 溶解力增強 極 端 pH 廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng),生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的復(fù)性與重折疊 包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)： 將多肽鏈中被拆開的游離巰基

26、重新折疊 通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性效率取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競爭，涉及兩種疏水作用： 分子內(nèi)疏水相互作用，可促進(jìn)正確折疊； 部分折疊肽鏈分子間的疏水相互作用，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),一個有效、理想的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備的特點： 活性蛋白質(zhì)的回收率高 正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤折疊的蛋白質(zhì)分離 折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品 折疊復(fù)性方法易于放大 復(fù)性過程耗時較少,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),五、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 2.融合蛋

27、白 將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，這種方式表達(dá)的蛋白. 優(yōu)點： 穩(wěn)定性加強；具有較高的水溶性和一定的生物活性；能高效表達(dá)；易于分離純化.,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),融合基因：通常是指通過自發(fā)突變事件形成的或是應(yīng)用DNA 重組技術(shù)構(gòu)建的一類具有來自兩個或兩個以上不同基因的 核苷酸序列的新型基因。,融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個或數(shù)個不同基因的編碼序 列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。其中通常 受體細(xì)菌蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),融合蛋白質(zhì)配偶體：指融合蛋白質(zhì)中與

28、目標(biāo) 蛋白質(zhì)連接的別種蛋白質(zhì)組分。 常見的配偶體：葡萄球菌蛋白質(zhì)A(SPA)、鏈 球菌蛋白質(zhì)G(SPG)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 、 麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和硫氧還蛋白(Trx)。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建的三個原則： 首先，受體細(xì)菌結(jié)構(gòu)基因應(yīng)能高效表達(dá)，且其 表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡單純化。 其次，外源基因應(yīng)插在受體菌結(jié)構(gòu)基因的下游 區(qū)域，并為融合蛋白提供終止密碼子。另外，兩個 結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要，它直接 決定了融合蛋白的裂解方法。 最后，當(dāng)兩個蛋白編碼序列融合在一起時，外 源基因的表達(dá)取決于其正確的翻

29、譯閱讀框架。,生命科學(xué)學(xué)院,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),用融合載體組合表達(dá)融合蛋白質(zhì)： 以Ecoli. lacZ為靶基因的組合最典型，含三個不同 載體，每個載體都有一個lacZ啟動子和SD序列，且在 lacZ基因下游部位具有一EcoR識別序列 (GAATTC) 5上游存在著不同數(shù)量的G-C堿基對。三種情況必有一 個保持著正確的讀碼結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生出真實的融合蛋白質(zhì)。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),生命科學(xué)學(xué)院,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),大腸桿菌甘露醇-1-磷酸脫氫酶基因(mtld) 引

30、物 引物1：5GTTGGATCCATGAAAGCATTACATTTTGGCG 3 引入BamHI酶切位點 引物2：5TGGGAGCTCATTATTGCATTGCTTTATAAGCG3 引入SacI酶切位點,全長1149bp，382個氨基酸，45kD,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),融合蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點： 第一個顯著特點是穩(wěn)定性大大增加。 第二個特點是融合蛋白質(zhì)的多肽片段有可能構(gòu)成 信號肽序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)分配到細(xì)胞的正確部位。 第三個特點是分離純化簡單?？筛鶕?jù)受體細(xì)菌蛋 白的特異性抗體、配體底物等迅速純化融合蛋白質(zhì)。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),融合蛋白

31、質(zhì)的純化 基本原理： 利用與融合蛋白質(zhì)配偶體相對應(yīng)的配 體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體 之間的相互作用，過柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來，其 它蛋白質(zhì)則流出柱外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化 的融合蛋白質(zhì)。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),異源蛋白質(zhì)的回收： 將其中大腸桿菌多肽組分切除掉。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種。 化學(xué)斷裂法：最佳試劑為溴化氰，作用于甲硫氨酸側(cè)鏈進(jìn)行硫醚基反應(yīng)，后水解斷裂。 蛋白質(zhì)酶法：每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點決定簇。,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),五、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)

32、形式 3. 整合型外源蛋白 外源蛋白的基因序列在宿主細(xì)胞染色體的同源序列的介導(dǎo)下，整合到宿主細(xì)胞的染色體上，進(jìn)行表達(dá)的方式。 4.分泌型外源蛋白 編碼的外源蛋白在某種機(jī)制下分泌到細(xì)胞外的這類蛋白。 優(yōu)點： 簡化純化處理工藝；減少外源蛋白降解的概率；有利于形成正確地空間構(gòu)想，獲得較好的生物活性或免疫原性,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),蛋白質(zhì)的外泌表達(dá)型 把所表達(dá)的目標(biāo)蛋白外泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中可以進(jìn)一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。 目前成功的例子主要是采用以下方案: （1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達(dá) （2）與一些能提高細(xì)胞外膜通透性的因子融合或共表達(dá) （

33、3）改變培養(yǎng)基的成分 歸納現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示這些方法僅對外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 1. 選擇強啟動子序列，如tac 等 2. 調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離 一般為5-9bp 距離過長或過短都影響真核基因的表達(dá)。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離 3. 改變起始密碼下面的幾組密碼子 能提高翻譯的起始效率 4. 增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 5. 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)

34、系 （1）誘導(dǎo)表達(dá) 將宿主生長代謝與外源基因表達(dá)分開 一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo) PL啟動子是溫度誘導(dǎo)型:,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 5. 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 （1）誘導(dǎo)表達(dá) tac啟動子是藥物誘導(dǎo)型 調(diào)節(jié)基因lac I（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。 無IPTG 阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。 有IPTG 阻遏物與IPTG結(jié)合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),AmpR,Plasmid pGEX-KG,GST,lacIq

35、,Ptac Promoter,Ampr,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 5. 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 （2）表達(dá)載體誘導(dǎo)復(fù)制 將宿主的生長與載體的復(fù)制分開。,當(dāng)宿主大量生長后，再誘導(dǎo)載體制粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。,當(dāng)需要宿主大量生長時，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 防止被宿主的酶降解。 （1）設(shè)計成融合蛋白 這是避免被降解的最好措施。 N末端：由原核基因編碼一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。,質(zhì)?；虍a(chǎn)物,目的基因產(chǎn)物,N,C,切割,生命

36、科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 （2） 使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解 減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。 1)使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。 2)大腸桿菌的htp R基因突變也減少蛋白酶的降解作用。 3)T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶?？砂裵in增加到載體上。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 （3）表達(dá)分泌蛋白,細(xì)胞質(zhì),外膜,內(nèi)膜,周間質(zhì),質(zhì)粒,染色體,“外排”： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液

37、中。 “分泌”： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 （3）表達(dá)分泌蛋白 細(xì)菌蛋白分泌的條件： 有信號肽:位于N端，一般為15-30aa 。真核與原核的結(jié)構(gòu)相似, 功能相似，可以互換。,堿性氨基酸,N,疏水氨基酸核心區(qū),切割位點,Arg、Lys,Leu、Ile,AlaGlySer,信號肽酶,外源蛋白,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 （3）表達(dá)分泌蛋白 細(xì)菌蛋白分泌的條件： 蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的aa 序列:為

38、蛋白指明目的地。 細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機(jī)制:信號肽酶I、信號肽酶II等近20多種蛋白質(zhì)的參與。 真核細(xì)胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達(dá)； 但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測 1.western blotting,前提是：表達(dá)產(chǎn)物是已知蛋白,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測 2. HPLC高效液相層析,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測 3.聚丙烯酰胺凝膠電泳,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測 4.等電聚焦電泳,生命科學(xué)

39、學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測 5.雙向電泳,生命科學(xué)學(xué)院,第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測 6.免疫電泳 7.放射免疫測定 8.酶聯(lián)免疫吸附試驗,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),原核表達(dá)系統(tǒng)與真核表達(dá)系統(tǒng)的區(qū)別？ 1.原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)是原核細(xì)胞; 真核表達(dá)系統(tǒng)則是在真核細(xì)胞里例如酵母細(xì)胞, 昆蟲細(xì)胞, 哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。 2.兩種表達(dá)系統(tǒng)都是通過含有原核或者真核啟動子以及其他其他表達(dá)相關(guān)元件的質(zhì)粒系統(tǒng)來實現(xiàn)外源基因的表達(dá)。 3.原核表達(dá)系統(tǒng)與真核表達(dá)系統(tǒng)相比,表達(dá)量效率便于優(yōu)化調(diào)整,表達(dá)量高. 但用來表達(dá)真核來源的

40、外源基因時,由于蛋白折疊和糖鏈修飾不同,因此其應(yīng)用受限. 真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量相對較低, 雖然酵母和昆蟲系統(tǒng)表達(dá)量相對較高,但是在表達(dá)哺乳細(xì)胞來源基因同樣存在折疊和糖鏈修飾的不足。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),一、真核生物基因表達(dá)與調(diào)控的特點 1.基因組DNA的存在形式可影響基因表達(dá) 2.轉(zhuǎn)錄與翻譯不偶聯(lián) 3.調(diào)控是多層次的 4.具有組織和細(xì)胞類型特異性 5.對信號分子反應(yīng)不同,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),二、真核生物基因表達(dá)載體的組成特征,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),二、真核生物基因表達(dá)載體的組成特征 1.原核DNA序列 2.啟

41、動子 組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織特異性啟動子、 雜合啟動子 3.增強子 4.終止子 5.內(nèi)含子 6.polyA加尾信號 7.選擇標(biāo)記基因和報告基因,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),三、真核表達(dá)的受體系統(tǒng) 1.酵母表達(dá)系統(tǒng) 酵母是一類最簡單的真核生物,其生長代謝與原核生物相似；但在基因表達(dá)與調(diào)控方面類似于高等生物。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),A 酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征,酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達(dá)系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外

42、源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢,全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便 能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中 具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng) 大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉 不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認(rèn)定為安全的 基因工程受體系統(tǒng)（GRAS） 酵母菌是最簡單的真核模式生物,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),B 常用的宿主 釀酒酵母宿主菌 巴斯德畢赤酵母宿主菌 乳酸克努維酵母宿主菌 多型漢森酵母宿主菌,其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡， 但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。,由畢赤酵母表達(dá)

43、應(yīng)用于臨床的蛋白目前有胰島素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多種抗體等。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),C 酵母基因表達(dá)載體 酵母載體可以攜帶外源基因在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代DNA和RNA單位。,酵母菌中的野生型質(zhì)粒,酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),DNA復(fù)制起始區(qū)（含兩類復(fù)制起始序列） 選擇標(biāo)記（營養(yǎng)缺陷型或顯性選擇標(biāo)記） 有絲分裂穩(wěn)定區(qū) 表達(dá)盒(啟動子、分泌信號序列、終止子等),生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),營養(yǎng)缺陷型

44、互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如： LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE,但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),酵母基因表達(dá)載體的種類： YRp類（yeast replication plasmid 自主復(fù)制型質(zhì)粒） YEp類（yeast episomal plasmid 附加體質(zhì)粒） YIp類（yeast integrative plasmid 整合型質(zhì)粒） YCp類（yeast centromeric plasmid 著絲粒質(zhì)粒） YAC 酵母人工染色體,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),

45、含有ARS的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建： ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個ARS元件。酵母菌自主復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建組成包括復(fù)制子、標(biāo)記基因、提供克隆位點的大腸桿菌質(zhì)粒DNA。 以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp 以2質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為Yep 上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個，但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建: 在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為Y

46、Ip。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建: CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列 將CEN DNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱YCp YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1 - 5個,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),D 酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng),酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。但該程序操作周

47、期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約。 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個顯著特點是，一個受體細(xì)胞可同時接納多個質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25-33%。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、 熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性： 吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍 共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法 酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG

48、，它對受電擊的細(xì)胞具有較很大的負(fù)作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105 /gDNA。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇,釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng),釀酒酵母基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌；且發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醇。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),

49、乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng),乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。 乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),1、畢赤酵母是需氧酵母菌，在有氧條件下能高密度生長，因 此有利于擴(kuò)大生產(chǎn)獲得高濃度細(xì)胞，從而進(jìn)行高效表達(dá) 2、通過質(zhì)粒整合到畢赤酵母基因組的外源基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不 易丟失；且外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中， 能夠篩選到高表達(dá)菌株 3、畢赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的強

50、啟動 子特別適用于外源基因的調(diào)控表達(dá),巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),4、畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中蛋白很少，使得分泌性的外 源蛋白容易從培養(yǎng)基的基質(zhì)中分離 5、畢赤酵母對外源蛋白產(chǎn)物進(jìn)行N-乙酰糖基化修飾的結(jié)構(gòu)為 高甘露糖型，糖鏈平均為814個甘露糖基，更接近于高等生 物，且聚糖末端不含 1，3連接的甘露糖殘基(有強的免疫原性) ，因而適用于臨床應(yīng)用 6、使用方便、簡單，而且成本較低,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),生長迅速 乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子 表達(dá)的可誘導(dǎo)性,已有百余種具有經(jīng)濟(jì)價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母 系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。,生命科學(xué)學(xué)院,第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng), 甲醇酵母的生物學(xué) AOX1 and AOX2 Mut+ and Muts 表達(dá)載體和受體菌 pPIC3.5K（胞內(nèi)表達(dá)） pPIC9.3K（分泌表達(dá)） pAO81