1、細胞體外培養(yǎng)實驗流程一、 細胞復(fù)蘇1. 準備：紫外照臺30min，準備好高壓滅菌好的吸管、移液管、離心管、廢液缸、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基（含fbs），水浴箱開啟到37，75%乙醇清洗雙手，培養(yǎng)基用前37溫育20min，酒精擦拭后放入無菌操作臺，點燃酒精燈。2. 灼燒離心管管口、塞子和滴管，用滴管取5ml培養(yǎng)基加入離心管中。3. 戴好防護用具，從液氮中取出凍存管后立即放入37水浴箱中，輕輕搖晃凍存管，保證細胞1min內(nèi)融化。以75%酒精擦拭凍存管外部，移入無菌工作臺。4. 用吸細胞液的從凍存管中將細胞懸液完全吸出加入到已裝有培養(yǎng)基的離心管中，塞子塞離心管，2000rpm，離心4min，棄上清。5. 往離

2、心管中加培養(yǎng)基（含fbs）5ml，用吸細胞懸液的滴管輕輕吹打，使細胞混勻，將離心管中的細胞懸液全部吸出加入到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶平放，輕輕晃動，使細胞均勻貼壁，標記好細胞名稱、日期、培養(yǎng)人，放入37，5%的co2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6. 收拾所用物品，75%酒精噴灑消毒。注意：1. 離心時轉(zhuǎn)速太高，離心時間過久都易對細胞造成傷害。2. 滴管一定要嚴格分開，不能混用，防止細胞污染。3. dmso常溫下對細胞毒性較大，故凍存細胞復(fù)蘇后應(yīng)立即洗滌冷凍保護劑。二、 細胞換液1. 將培養(yǎng)瓶從co2培養(yǎng)箱中取出，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)（判斷生長情況，并確證未發(fā)生污染）后轉(zhuǎn)入無菌操作臺內(nèi)。2. 準備：紫外照臺

3、30min，準備好高壓滅菌好的吸管、移液管、離心管、廢液缸、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基（含fbs），水浴箱開啟到37，75%乙醇清洗雙手，培養(yǎng)基用前37溫育20min，酒精擦拭后放入無菌操作臺，點燃酒精燈。3. 酒精燈外焰灼燒培養(yǎng)瓶瓶口、瓶塞和滴管，培養(yǎng)瓶傾斜，吸出舊液，盡量吸凈。4. 吸取培養(yǎng)基（含fbs）5ml，加到培養(yǎng)瓶中（fbs終濃度為10%）。（若死細胞較多則可以先用pbs洗一次，再加培養(yǎng)基。）5. 將培養(yǎng)瓶與瓶蓋過火，旋緊瓶塞后回旋半圈，平放回co2培養(yǎng)箱。6. 收拾所用物品，75%酒精噴灑消毒。注意：1. 打開和蓋緊培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶前后均需旋轉(zhuǎn)灼燒瓶口和瓶蓋。2. 各滴管一定要嚴格分開，不能混

4、用。3. 將pbs注入到培養(yǎng)瓶中，應(yīng)將液體打到?jīng)]有細胞的那一面。4. 培養(yǎng)液以沒過細胞為宜。5. 細胞溶液變黃或死細胞過多時換液。6. 倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，瓶口應(yīng)盡量遠離廢液缸，以免造成污染三、 細胞計數(shù)和活力測定（一）細胞計數(shù) 細胞數(shù)/ml=4大格細胞總數(shù)/4104稀釋倍數(shù)1. 紫外照臺30min，75%酒精棉簽清潔蓋玻片及計數(shù)板，用干紗布或棉簽再擦一遍，放好蓋玻片。2. 用滴管從已經(jīng)吹打混勻的細胞懸液中吸出少許，滴加在蓋玻片邊緣，使懸液充滿蓋玻片和計數(shù)板之間，靜置3min。3. 觀察計數(shù)：壓線的記左不計右，記上不記下，成團細胞只記為1個。先用4倍鏡找出大位置，再用10鏡計數(shù)。4. 計數(shù)完

5、用75%酒精棉簽擦洗蓋玻片和計數(shù)板。（二）細胞活力測定1. 紫外照臺30min，吸取細胞懸液0.5ml加入試管中。2. 加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色23min。3. 吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。4. 鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。注意：1. 細胞計數(shù)時蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊凹槽中。2. 活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。四、 細胞傳代1. 配完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基:fbs=1:92. 取出細胞，顯微鏡下觀察細胞形

6、態(tài)和密度，確定細胞生長狀況，是否需要傳代。3. 紫外照臺30min，75%酒精擦拭雙手，將預(yù)熱后的培養(yǎng)基、pbs、胰酶培養(yǎng)基等用酒精擦拭后移入超凈臺，將廢液缸噴足酒精移入超凈臺，取酒精棉放入超凈臺。4. 點燃酒精燈，將培養(yǎng)瓶用75%酒精擦拭后移入工作臺，將瓶口和瓶蓋過火灼燒。5. 在確定細胞生長狀況良好且沒有污染的情況下，用適量pbs清洗細胞表面，并棄去pbs。6. 加入1ml 0.25%胰酶消化細胞，此時可將細胞置于37細胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化。胰酶以鋪平培養(yǎng)瓶底部為宜。倒置顯微鏡下觀察，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度（一般2-5min）。立即棄去消化液加入3ml完全培養(yǎng)基終

7、止消化。（注意更換吸管）7. 用吸細胞液的滴管輕柔吹打，保證培養(yǎng)瓶底的每個角落都吹打到，斜坡處不能忽略，把培養(yǎng)瓶中所有細胞懸液用吸細胞液的滴管移入離心管中，再用滴管吹打混勻細胞懸液。8. 取一滴細胞懸液進行計數(shù)，計算好細胞傳代培養(yǎng)時稀釋倍數(shù)（細胞傳代密度不低于5105個/ml。9. 傳代：先用滴管吹打混勻細胞懸液，按一定比例稀釋，標記好細胞名稱，傳代培養(yǎng)時間，培養(yǎng)員，細胞個數(shù)，平放入co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。10. 收拾所用物品、用75%酒精噴灑操作臺。附：培養(yǎng)細胞若需給動物注射，在消化后用pbs清洗3-5次后收集細胞并計數(shù)，用pbs清洗細胞是為防止給動物注射時殘留的fbs造成動物炎癥。注意：1.

8、 對于難消化的細胞在用胰酶消化前，先用12ml 4 pbs沖洗一遍，較易消化的細胞不需要此步驟。2. 一定要防止細胞過消化！因過消化，使細胞成團，不均勻，且對細胞傷害很大，影響細胞貼壁和導(dǎo)致生長狀態(tài)差等。*過消化特征：a.在沒有加入完全培養(yǎng)基終止消化前就有成團細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，胰酶里出現(xiàn)很多懸浮物，為掉下來的細胞。b.培養(yǎng)瓶底板上本身為白茫茫（細胞貼壁生長），而過消化后細胞脫壁掉下來，則可見培養(yǎng)瓶底板有一片片空隙。出現(xiàn)過消化時立即加入含fbs的培養(yǎng)基終止消化。3. 把試管中細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中時，每次滴管在試管中取液時都要輕柔吹打液體，以防止細胞成團不均，用力吹打和氣泡產(chǎn)生對細胞都有傷害

9、，影響在培養(yǎng)瓶中生長。5. 一般細胞生長鋪至瓶底約80%，則可傳代或用來做實驗，否則細胞進入生長平臺期進而缺少營養(yǎng)而狀態(tài)老化，不易用于后續(xù)實驗。五、細胞凍存1. 選對數(shù)增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前1天換半量或全量培養(yǎng)基。與冷凍細胞應(yīng)生長良好且存活率高，約為80-90%致密度。2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、fbs（10%），逐滴加入二甲基亞砜（dmso）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。3. 依細胞傳代培養(yǎng)的操作，收集細胞于離心管中，取少量細胞懸液計數(shù)細胞濃度及凍前存活率，一般細胞凍存濃度為1-5106個/ml。4. 離心管管口和管塞過火灼燒，塞好后，2000rpm離心4min，去上清，加適量完全培養(yǎng)基，混勻。5. 取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管，制成