1、香菇多糖提取,張志挺 14生科一班 29號,1、香菇多糖 (1) 香菇多糖結(jié)構(gòu)式,分子式： C42H72O36 n 分子量：1152.9995n,(2) 香菇多糖性質(zhì) 香菇多糖（lentinan;LNT）是從香菇中分離純化的一種葡聚糖，是以增強T細胞和巨噬細胞功能為主的免疫增強劑。 密度：1.88g/cm3；沸點：1472 at 760 mmHg。 溶于堿溶液或甲酸，微溶于熱水或二甲亞砜，不溶于冷水、醇、乙醚、氯仿、吡啶或六甲基磷酰胺。對硫酸和鹽酸穩(wěn)定。,(3) 香菇多糖的功能 香菇多糖具有激活細胞免疫、調(diào)節(jié)多種體液免疫因子、誘導(dǎo)-干擾素生成，調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)白細胞對腫瘤浸潤，導(dǎo)致腫

2、瘤部位血管擴張、出血、壞死，阻止病毒與宿主細胞的結(jié)合，提高SOD超氧化物歧化酶活性，抑制MDA丙二醛 生成，抗脂質(zhì)氧化，降低膽固醇，調(diào)節(jié)糖代謝、改善糖耐量、擴張胃腸道產(chǎn)生飽腹感而減輕食欲，降低血糖等功能。 (4) 香菇多糖的應(yīng)用 、香菇多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用 香菇多糖在治療胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等方面具有良好療效。作為免疫輔助藥物，香菇多糖主要用來抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移，提高腫瘤對化療藥物的敏感性，改善患者的身體狀況，延長其壽命。 香菇多糖與化療劑聯(lián)合使用，有減毒、增效的作用。 香菇多糖配合其他藥物治療慢性乙型肝炎，可提高乙肝病毒標(biāo)志物的轉(zhuǎn)陰作用，減少抗病毒藥物的副作用。此外，香菇多糖可用于治療

3、結(jié)核桿菌感染。 、香菇多糖在保健食品領(lǐng)域的應(yīng)用 香菇多糖是一種特殊的生物活性物質(zhì)，是一種生物反應(yīng)增強劑和調(diào)節(jié)劑，它能增強體液免疫和細胞免疫功能。香菇多糖的抗病毒作用機制可能在于其提高感染細胞免疫力，增強細胞膜的穩(wěn)定性，抑制細胞病變，促進細胞修復(fù)等功能。同時，香菇多糖還具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性。因此，香菇多糖是一種有待開發(fā)的抗流感的保健食品。,2、香菇多糖的發(fā)展歷史 (1) 誕生與發(fā)展過程 1968年GoroChihara首先從香菇子實體中浸提出6種香菇多糖,并證明其中一種具有明顯的抗腫 瘤作用,定名為Lentinan 1970 年Chihard 和Sasaki 用熱水浸提結(jié)合有機溶劑沉淀從香菇中提

4、取到另外4 種多糖。 1986年獲日本厚生省批準(zhǔn)生產(chǎn)并外銷。 1988年我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)進口，現(xiàn)今我國已有幾家國產(chǎn)LNT上市(如南京振中和福州梅峰等)。香菇多糖由于是單一組分，質(zhì)量易于控制，且具有療效高，劑量低，毒副作用小等優(yōu)點，受到醫(yī)生的青睞。 自此,世界各地掀起了一股從大型真菌中尋找抗腫瘤藥物的熱潮。有關(guān)香菇多糖的研究尤其活躍,包括提取工藝及分離純 化研究,香菇多糖理化性質(zhì)及藥用價值研究 。但對多糖理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、藥效、藥理等方面仍無定論,仍須繼續(xù)深入研究。,(2) 各種生產(chǎn)方法比較 主要的多糖提取方法有如下幾種: 熱水浸提法、 酸（堿）浸提法、 微波提取法、超聲波提取法、復(fù)合酶解法等等。

5、香菇多糖提取的工藝流程 多糖提取的常規(guī)工藝 原料預(yù)處理水(或酸)浸提浸提物真空濃縮濃縮液酒精沉淀沉淀物sevage法脫蛋白水相丙酮洗滌多糖粗制品 采用復(fù)合酶解工藝 原料預(yù)處理復(fù)合酶解酶解液真空濃縮濃縮液酒精沉淀沉淀物丙酮洗滌多糖粗制品 復(fù)合酶解、 酸處理結(jié)合熱水浸提法提取香菇多糖的改進工藝 原料預(yù)處理復(fù)合酶解酶解液水浸提酸浸提浸提物空濃縮濃縮液酒精沉淀沉淀物sevage法脫蛋白水相丙酮洗滌多糖粗制品 操作要點的對比 熱水浸提法 向香菇處理物中加入 20倍體積的蒸餾水,并在 40 水浴恒溫下浸泡 4h。放置冰箱冷凍柜中冷凍過夜。將香菇浸泡液從冰箱中取出, 解凍后在恒溫水浴箱內(nèi)分別抽提 30min

6、、 60min、90min ,用4層紗布過濾后收集濾液。向濾渣中加入20倍體積的蒸餾水再抽提一次, 沸煮時間同上用 4層紗布過濾后收集濾液,合并兩次濾液。,酸浸提法 向香菇處理物中加鹽酸溶液使其最終濃度分別為 0.3mol/L、0.4mol/L、 0.5mol/L , 置于60恒溫水浴中浸提 8h , 加適量的NaOH中和至中性,過濾,濃縮。 微波提取法 向香菇處理物中按1:25加入去離子水浸泡過夜,粉碎,在一定微波條件下提取,冷卻后離心,從上清液中取樣測定其中多糖含量。 超聲波提取法 向香菇處理物中加入蒸餾水，進行超聲波處理浸提。8000r/min離心五分鐘，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10

7、20ml，加入兩倍體積的無水乙醇，進行醇沉。放置過夜后再次離心，留取沉淀物，干燥至恒重。 復(fù)合酶浸提法 向香菇處理物的中加 0.1g纖維素酶和0.5g果膠酶,目的是為了酶解細胞表面結(jié)構(gòu)及細胞間連接物,使其部分糖類物質(zhì)的溶出。往酶解后的香菇處理物中加入 20倍體積的蒸餾水,并在40水浴恒溫下浸泡80min 。迅速升溫沸騰90min ,后過濾得濾液。離心沉淀,上清液濃縮,乙醇沉淀。 復(fù)合酶解,酸與熱水相結(jié)合浸提法 向香菇處理物中加 0.1g纖維素酶和 0.5g果膠酶,目的是為了酶解細胞表面結(jié)構(gòu)及細胞間連接物, 使其部分糖類物質(zhì)的溶出。加 20倍體積的水在 40 水浴恒溫下浸泡 80min。后再迅速

8、升溫煮沸 60min,用 4層紗布過濾后收集濾液, 再調(diào)節(jié) pH分別為 4.5、5.0、5.5 ,進行酸浸提, 然后再用 4層紗布過濾后收集濾液。合并兩次濾液。濃縮。,(3) 現(xiàn)在常用的生產(chǎn)方法 以上幾種方法均有優(yōu)點和缺點，而現(xiàn)如今也都在被使用！ 3 、生產(chǎn)技術(shù) (1)生產(chǎn)原理: 多糖溶于熱水,不溶于60%以上乙醇,也不溶于氯仿正丁醇.熱水浸提時，香菇組織膨脹破裂，多糖成分浸出，所以用熱水提取,乙醇沉淀除去部分醇溶性雜質(zhì);因為熱水也可以將蛋白類物質(zhì)提取出來,所以用氯仿正丁醇萃取除去提取液中的蛋白。 (2) 原料及要求: 將香菇清洗干凈，除去其根部，將剩下的菌傘擠壓，切小塊放入真空干燥箱干燥，待

9、香菇恒質(zhì)量，放入粉碎機中粉碎，將粉碎后的香菇粉依次通過40，60，80，100目的篩子，得到40目以下、4060目、6080目、80100目、100目粒度以上的樣品，過篩之后把各級香菇粉分別裝到清潔干燥的燒杯中，編號貼上標(biāo)簽，置于真空干燥箱中待用。,(3) 工藝流程：,熱水法提取香菇多糖工藝流程圖,【sevage法脫蛋白】 正丁醇、氯仿混合溶液（正丁醇：氯仿=1：4或1：5）和樣物提取液混合并且振蕩，不需要加熱，利用離心機離心，直到離液面交界處無白色混懸，也就是蛋白質(zhì)介于提取液與試劑交界處即可，最后分別提取即可。,(4) 工藝流程說明及主要工藝參數(shù)： 熱水浸提 向香菇處理物中加入 20倍體積的

10、蒸餾水,并在 40 水浴恒溫下浸泡 4h。放置冰箱冷凍柜中冷凍過夜。將香菇浸泡液從冰箱中取出, 解凍后在恒溫水浴箱內(nèi)分別抽提 30min、 60min、90min ,用4層紗布過濾后收集濾液。向濾渣中加入20倍體積的蒸餾水再抽提一次, 沸煮時間同上，用 4層紗布過濾后收集濾液,合并兩次濾液。 真空濃縮 將上述濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在75 , 0.09Pa大氣壓下進行濃縮, 收集濃縮液。并用高速離心機在 6000rpm離心 15min , 目的是去除蛋白質(zhì)和雜質(zhì),得上清液。 酒精沉淀分離 在濃縮液中加入 4倍體積的 95%乙醇, 使香菇多糖呈絮狀凝膠物沉淀析出,而大部分蛋白質(zhì)和其它成分保留在溶液中,

11、再用高速離心機在 7000rpm下離心 15min得沉淀。 sevage法脫蛋白 將上述沉淀溶于適量的蒸餾水中,分別加入 20% 體積的氯仿和 7% 體積的異戊醇生成絮狀凝聚物, 用高速離心機在5000rpm離心15min得沉淀。重復(fù)上述操作, 直至無凝聚物生成。 丙酮洗滌脫水 將酒精沉淀物用丙酮洗滌脫水兩次, 倒入放有干燥濾紙的培養(yǎng)皿中 (濾紙重0.98g) ,然后將培養(yǎng)皿放在 50 的烘干箱中進行干燥 3h ,得到香菇多糖粗制品。 粗多糖純化 Sephadex G-100凝膠充分溶脹后裝柱，用蒸餾水平衡48h。取上述香菇多糖提取物溶于蒸餾水中，離心除去不溶物，上清液上柱分離，用蒸餾水洗脫，

12、洗脫速度5mL/20min，200nm波長紫外檢測，收集主要峰部分，冷凍干燥的白色香菇多糖，并稱重。 (5) 主要生產(chǎn)設(shè)備： 燒杯（若干），玻璃棒，溫度計，錐形瓶（若干），漏斗，水浴鍋，稱量天平，臺式恒溫振蕩器,臺式離心機，紫外線分光光度計,(6) 關(guān)鍵過程與關(guān)鍵技術(shù) 多糖的提取 取香菇10g，于組織搗碎機內(nèi)粉碎，加入20倍量水，90 水浴加熱30min，抽濾，得濾液，加活性炭（1mg/mL），攪拌吸附1h，抽濾，得濾液，用氯仿萃取（3次）以除盡蛋白質(zhì)，萃余液中加無水乙醇，使其乙醇最終濃度為80%，沉淀12h后，于離心機中離心（4000r/min）30min,沉淀物分別用無水乙醇，丙酮，乙醚洗

13、滌三次，既得香菇多糖提取物。 多糖純化 凝膠柱層析原理：所謂層析，就是利用樣品中各組成成分的理化性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相兩相中，由于各組分隨流動相前進的速率不同，從而把它們分離開來的技術(shù)。 操作步驟： Sephadex G-100凝膠充分溶脹后裝柱，用蒸餾水平衡48h。取上述香菇多糖提取物溶于蒸餾水中，離心除去不溶物，上清液上柱分離，用蒸餾水洗脫，洗脫速度5mL/20min，200nm波長紫外檢測，收集主要峰部分，冷凍干燥的白色香菇多糖，并稱重。 香菇多糖分析檢測 定性分析苯酚-硫酸法 酚-硫酸試劑：酚3g，濃硫酸5mL，溶于95mL無水乙醇中，噴后，110,加熱幾分

14、鐘，糖顯棕色。,定量分析分光光度法 A 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取60 干燥至恒重的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1g，至于100mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，用移液管量取對照品溶液0、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，再各精密吸取1mL，至于具塞試管中，準(zhǔn)確移取8%苯酚溶液1mL，快速加入濃硫酸5mL，至于水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫，橘黃色由溶度從小到大而逐漸加深，將溶液于490nm波長的可見分光光度計處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 B 樣品多糖測定 精密城區(qū)香菇多糖10.0mg，加水溶解，定量轉(zhuǎn)移入100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。準(zhǔn)去吸取2.00mL，按上述實驗方法顯色，測定吸光度，計算香菇多糖含量。,(7) 該技術(shù)的優(yōu)缺點： 優(yōu)點：有可靠的生產(chǎn)數(shù)據(jù)，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，不易招致雜菌污染。 缺點: 能耗