1、第七節(jié) 抗體分子的改造和基因工程,自1975年Catton 和Milstein等研究制造出單克隆抗體（MAb）技術(shù)以來(lái)，獲得了迅速的發(fā)展和極為廣泛的應(yīng)用。但也確實(shí)存在不少難以克服的問(wèn)題，如絕大多數(shù)的Mab是鼠源性的，對(duì)人有較強(qiáng)的免疫原性。如果用于人的治療，不出2周就會(huì)產(chǎn)生人對(duì)鼠血清的免疫應(yīng)答，患者體內(nèi)存在的人抗鼠抗體（human anti-mouse antibody, HAMA），不僅降低了療效，嚴(yán)重的可引起患者出現(xiàn)血清病。,隨著分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)、特別是分子生物學(xué)的發(fā)展，人們開(kāi)始著手利用DNA分子重組技術(shù)，改造和生產(chǎn)所需要的特異性單鏈抗體、免疫粘連素、超變區(qū)多肽，直到用絲狀噬菌體表面呈現(xiàn)

2、技術(shù)構(gòu)建和篩選抗體基因文庫(kù)。,一、雙特異性抗體,免疫球蛋白分子具有重鏈、輕鏈組成的4條肽鏈結(jié)構(gòu)，它們共同組成2個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)。由于2個(gè)結(jié)合點(diǎn)的抗原特異性相同，故表現(xiàn)為單一特異性。,雙特異性抗體是將2個(gè)結(jié)合點(diǎn)表現(xiàn)為不同的特異性，抗體的一個(gè)結(jié)合點(diǎn)的特異性表現(xiàn)為靶細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）結(jié)合，另一結(jié)合點(diǎn)可與藥物（如蓖麻毒素、抗癌藥物、細(xì)胞毒性細(xì)胞）結(jié)合。,這種雙特異性的結(jié)合，可使作用物直接地、高密度地作用于靶細(xì)胞，提高了療效，從而可相對(duì)地減少對(duì)患者的副作用。,制備雙特異性抗體的方法主要有3種方法：,（1）雜化雜交瘤技術(shù)：將具有某種特異性（如抗瘤細(xì)胞）的Mab細(xì)胞株與具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾細(xì)胞

3、進(jìn)行融合，即產(chǎn)生出雜化雜交瘤細(xì)胞株的二價(jià)瘤體。,它們分泌的是重鏈、輕鏈被雜化的抗體分子，有10種形式： 重鏈、輕鏈都無(wú)改變，保持原特異性的配對(duì)抗體分子： LH-HL，KG-GK 重鏈特異性相同的配對(duì)抗體分子： LH-HK，KH-HK KG-GL，LG-GL 重鏈、輕鏈特異性不同的配對(duì)抗體分子： LH-GK，LH-GL KH-GL，KH-GK,在這些雜化抗體分子中，只有LH-GK配對(duì)的才是所需的雙功能抗體分子。,（2）化學(xué)交聯(lián)法：Nisonoff和Rivers最早從事這方面的研究?；瘜W(xué)交聯(lián)的方法無(wú)需經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合，所以比較簡(jiǎn)便易行。 通常利用重鏈與輕鏈這間的二硫鏈經(jīng)還原和再氧化，將兩種不同特異性抗

4、體的半分子結(jié)合在一起?；蛴秒p功能交聯(lián)劑，如鄰苯酸酯等，把兩個(gè)抗體半分子交聯(lián)在一起。,用于制備雙功能抗體的Mab可以是完整分子，也可是經(jīng)胃酶水解獲得F（ab）2片段。后者在減少鼠源免疫原性方面，效果較好。,（3）利用基因工程技術(shù)將兩套重輕鏈基因?qū)牍撬枇黾?xì)胞或傳染瘤細(xì)胞中。 這種方法制備的雙功能抗體可選擇合適的穩(wěn)定區(qū)和合適的類(lèi)及亞類(lèi)，而得到較好的產(chǎn)量較高的雙功能抗體。由于只有較少的嵌合導(dǎo)入并整合到宿主基因組，故傳染瘤細(xì)胞更為穩(wěn)定，染色體不易丟失,二、嵌合抗體,在腫瘤治療中，帶有抗瘤藥物或同位素等的抗體具有導(dǎo)向作用，從而可定位診斷或定向殺傷腫瘤細(xì)胞。 為解決鼠源免疫M(jìn)ab免疫原性這一難題，人們又設(shè)

5、計(jì)了小鼠-人工嵌合抗體（chimerie antibody）的新型抗體。,其原理是取某一Mab基因的V區(qū)，與人Ig基因的C區(qū)連接，然后插入到表達(dá)質(zhì)粒中，傳染骨髓瘤細(xì)胞即產(chǎn)生出鼠-人嵌合抗體。 由于Ig的C區(qū)是人源的，這種抗體對(duì)人的免疫性就大為降低，采用不亞類(lèi)的人C區(qū)基因，便可改變抗體的效應(yīng)功能，以獲抗腫瘤的最佳效果。,鼠-人嵌合抗體并不能徹底清除鼠源免疫原性，于是進(jìn)一步提出重構(gòu)抗體的設(shè)想。 即：人化抗體,三、人化抗體,抗體的抗原結(jié)合區(qū)域（V）與空間結(jié)構(gòu)主要由抗體V區(qū)中3個(gè)CDRS（互補(bǔ)決定區(qū)）所決定，所以這一抗體的構(gòu)建是用原鼠IgV區(qū)中的CDR區(qū)插入到人IgV的框架區(qū)。,這樣構(gòu)建成的重組分子既

6、保留了結(jié)合抗原的功能，又消除了鼠源的免疫原性。這類(lèi)人化抗體（humanhized antibodies）也可稱(chēng)為重構(gòu)抗體。,為了構(gòu)建這類(lèi)抗體，首先需要測(cè)出MabV區(qū)的核苷酸序列，根據(jù)其中的CDRS序列，用全合成或點(diǎn)突變的方法將人Ig重構(gòu)成MabV區(qū)的CDRS序列，然后將這種重構(gòu)的V區(qū)基因與人IgC區(qū)基因連接，構(gòu)成完整的人Ig基因，再于骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。,四、單鏈抗體,用一編碼親水易折疊多肽的人工合成寡核苷酸，將重鏈V區(qū)（3）與輕鏈V區(qū)（5）端連接在一起（VH-linker-VL）即成單鏈抗體基因，將此基因克隆入原核或真核表達(dá)載體中，在原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)出的蛋白質(zhì)即為單鏈抗體（single c

7、hain antibodies）。 它能自發(fā)折疊成天然構(gòu)象，與抗原的結(jié)合力維持與原來(lái)完整抗體一樣。,五、免疫粘連素,把細(xì)胞受體或細(xì)胞間粘附分子（intercellular adhesion molcule, ICAM）與Ig的Fc段相連，即為免疫粘連素（immunoadhesin）。,Staunton等制成一種含有可溶性細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1（1CAM-1）的免疫粘連素，它能有效地和特異的抑制被惡性瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞對(duì)能產(chǎn)生1CAM-1表面的粘附。當(dāng)被感染的紅細(xì)胞與上述免疫粘連素結(jié)合后，F(xiàn)c片段可促使單核細(xì)胞的吞噬作用。 這種抗體可用于惡性瘧疾的治療。,T細(xì)胞表面抗原CD4是愛(ài)滋病病毒（human

8、 immunodeficiency virus，HIV）的受體，在免疫預(yù)防和免疫治療方面，免疫粘連素可能會(huì)提供一個(gè)新的途徑。,將Ig的Fc段與CD4形成的重組分子，可以中和HIV，但只是簡(jiǎn)單地結(jié)合會(huì)引起具Fc受體細(xì)胞的感染，而在體內(nèi)具有Fc受體的細(xì)胞相應(yīng)是多的，為此只有用定點(diǎn)突變或其他方法改變Fc段，使之不與Fc受體結(jié)合，便可有效地防治愛(ài)滋病。,六、抗體基因文庫(kù)的構(gòu)建和基因表達(dá)篩選的表面呈現(xiàn)技術(shù),1985年Smith將一基因片段克隆到載體噬菌體fd-tet的基因（g3）上，發(fā)現(xiàn)該基因所表達(dá)的蛋白與噬菌體基因表達(dá)的蛋白結(jié)合在一起呈現(xiàn)到噬菌體表面。這種表達(dá)的融合蛋白仍保留抗原特異性和生物活性，可通

9、過(guò)相應(yīng)抗原進(jìn)行檢測(cè)。,這樣我們不僅可以利用噬菌體來(lái)構(gòu)建基因文庫(kù)，而且可以獲得表達(dá)性的基因文庫(kù)，無(wú)疑對(duì)高效率地篩選和富集目的基因提供了極大的方便。 現(xiàn)在這一技術(shù)已被廣泛地用于抗體基因文庫(kù)，cDNA文庫(kù)、隨機(jī)多肽基因文庫(kù)和突變基因文庫(kù)的構(gòu)建和篩選等諸多方面。,絲狀噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)以絲狀噬菌體為表達(dá)載體，目的基因插入到噬菌體外殼蛋白基因內(nèi)，其天達(dá)產(chǎn)物呈現(xiàn)在噬菌體表面。,Ff絲狀噬菌體,Ff絲狀噬菌體呈柔性長(zhǎng)絲狀，直徑約為6.5nm,野生型體長(zhǎng)約為900nm。其基因組是一單鏈環(huán)狀DNA，全序列已經(jīng)測(cè)也，約含6000多個(gè)核苷酸，編碼10種蛋白質(zhì)。其中有5種蛋白組成外殼蛋白，基因（g8）在野生型噬菌體中

10、約有27003000個(gè)考貝，它所編碼的gp8蛋白是外殼蛋白的主要成分。它圍繞基因組DNA以螺旋對(duì)稱(chēng)的排列構(gòu)成圓管形的噬菌體外殼。除gp8外，不有4種少量的外殼蛋白：gp3、gp6、gp7和gp9，分別由基因、編碼，它們各有5個(gè)拷貝。,目的基因表達(dá)的蛋白如若想在噬菌體表面呈現(xiàn)，就必須插在這5種外殼的其中這一處。實(shí)驗(yàn)表明，在gp6、gp7、gp9中插入外源蛋白，都會(huì)影響其構(gòu)成外殼蛋白的功能，而在gp8和gp3的N端插入外源蛋白后，形成的融合蛋白既可在噬菌體表面呈現(xiàn)，也不影響噬菌體的完整性和穩(wěn)定性。,成熟的gp8含有50個(gè)氨基酸，從構(gòu)成外殼的功能來(lái)看可分為4個(gè)部分： （1）C端15個(gè)氨基酸偏堿性，與

11、DNA相結(jié)合，構(gòu)成外殼的內(nèi)壁，在此處的突變將影響與DNA的相互作用。 （2）2535位肽段具有高度的疏水性，借此特性分子間相互聚合，形成固牢的外殼。這段肽鏈的改變將會(huì)影響噬菌體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。 （3）從第6位的脯氨酸到C末端是連續(xù)的螺旋結(jié)構(gòu)，624位的螺旋肽段外露，在外殼上排列緊密，占據(jù)了噬菌體的大部分表面。如有稍大肽段插入，將會(huì)影響外殼的穩(wěn)定性。 （4）N端15位的氨基酸序列是丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-門(mén)冬氨酸-門(mén)冬氨酸（A-E-G-D-D），它外露于噬菌體表面，是外源肽段插入的最佳位置。,利用這一系統(tǒng)可以構(gòu)建表達(dá)性基因文庫(kù)，稱(chēng)為噬菌體呈現(xiàn)文庫(kù)。它最先被用于抗體基因文庫(kù)的構(gòu)建和篩選。雖然利用動(dòng)物

12、的免疫可以獲得循環(huán)多克隆抗體，用細(xì)胞融合方法可以獲得單克隆抗體，但利用基因工程的技術(shù)構(gòu)建抗體基因庫(kù)，再篩選所需的特異性抗生，不僅擺脫了繁重的工作量，也可獲得大量的、穩(wěn)定的抗體。而且隨著研究的不斷深入和發(fā)展，抗體的多樣性，親和力也大有提高。,在構(gòu)建噬菌體呈現(xiàn)抗體文庫(kù)技術(shù)中，主要有3個(gè)特點(diǎn)： （1）可用抗原制備出免疫吸附劑，將文庫(kù)的噬菌體與其反應(yīng)，再經(jīng)洗滌、洗脫得以捕獲和純化，將這種表達(dá)所需的特異性抗體的噬菌體感染大腸桿菌而得到繁殖。如此經(jīng)過(guò)親和結(jié)合洗滌洗脫繁殖的富集過(guò)程，稱(chēng)為“panning”（淘選），一輪paning便可富集1000倍。如此簡(jiǎn)便、高效率，是其他方法比似的。,（2）親和力成熟過(guò)程可由體內(nèi)轉(zhuǎn)為體外。如前所述，抗原物質(zhì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體的再次免疫，可獲得高親和力的抗體。這種在體內(nèi)出現(xiàn)的親和力成熟的現(xiàn)象，是由于細(xì)胞抗體基因在CDRS區(qū)域突變，再通過(guò)表面呈現(xiàn)技術(shù)加篩選，便可獲得親和力的特異抗體,（3）這種方法不僅可以獲得單鏈抗體，也可制備出重鏈、輕鏈結(jié)合的抗體（Fab）片段。 外源基因編碼的肽段在融合蛋白