1、基因治療,Company Logo,目錄,Company Logo,基因治療的定義,基因治療（gene therapy） 是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的。也包括轉(zhuǎn)基因等方面的技術(shù)應(yīng)用。也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。 從廣義說，凡是在基因水平上進(jìn)行操作而達(dá)到治療疾病的所有療法。,Company Logo,基因治療的發(fā)展史,Company Logo,基因治療的發(fā)展史,上世紀(jì)九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脫氨酶)基因缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重免疫缺損的四歲女孩，由美國國立衛(wèi)生研究院用ADA

2、基因治療，取得療效。“基因治療”研究熱從此波及全世界，起而效顰，為保障人類健康展現(xiàn)了美好的前景。,Company Logo,基因治療的發(fā)展史,人民網(wǎng)深圳2003年10月22日15：30急電 正在這里召開的深圳市政府新聞發(fā)布會(huì)向世界公布了一項(xiàng)振奮人心的消息：“個(gè)基因治療藥物在中國誕生” 。 世界首深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司研制開發(fā)的抗癌新藥“重組人p53腺病毒注射液”（商品名“今又生”），10月16日獲得國家儀器藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書。這標(biāo)志著我國在基因治療藥物研制和產(chǎn)業(yè)化方面已達(dá)世界領(lǐng)先水平，在國際競爭中搶占了先機(jī)。,世界第一個(gè)基因治療藥物在中國誕生,Company Logo,基因治療

3、的概述,基因治療的基本內(nèi)容： 基因診斷：產(chǎn)生基因缺陷的原因除了進(jìn)化障礙因素外，主要包括點(diǎn)突變、缺失、插入、重排等DNA分子畸變事件的發(fā)生。 目前已建立多種病變基因的診斷和定位方法：如PCR擴(kuò)增序列法、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法、人類基因庫搜尋法等,Company Logo,基因治療的發(fā)展史,基因分離：利用DNA重組技術(shù)克隆、鑒定、擴(kuò)增、純化用于治療的正常基因，并根據(jù)病變基因的定位，與特異性整合序列和基因表達(dá)調(diào)控原件進(jìn)行體外重組操作。 載體構(gòu)建：主要有病毒和非病毒兩大類，病毒載體一般都需要重新構(gòu)建。 基因轉(zhuǎn)移：關(guān)系到基因治療成敗的關(guān)鍵單元操作,Company Logo,基因治療的概述,根據(jù)靶細(xì)胞不同，

4、基因治療分為： 將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療目的。 將正?；蜣D(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞（精細(xì)胞、卵細(xì)胞中早期胚胎）使其發(fā)育成正常個(gè)體，顯然，這是理想的方法。實(shí)際上，這種靶細(xì)胞的遺傳修飾至今尚無實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。,體細(xì)胞基因治療：,生殖細(xì)胞基因治療：,Company Logo,基因治療的概述,生殖細(xì)胞的基因治療不僅可使遺傳疾病在當(dāng)代得到治療，而且還能將新基因傳給患者后代，使遺傳病得到根治。但生殖細(xì)胞的基因治療涉及問題較多，技術(shù)也較復(fù)雜。 因此，如今更多地是采用體細(xì)胞基因治療。 體細(xì)胞應(yīng)該是在體內(nèi)能保持相當(dāng)長的壽命或者具有分裂能力的細(xì)胞，這樣才能使被轉(zhuǎn)入的基因能有效地、長期地發(fā)揮“治

5、療”作用。因此干細(xì)胞、前體細(xì)胞都是理想的轉(zhuǎn)基因治療靶細(xì)胞。,Company Logo,基因治療的策略,體細(xì)胞基因治療的策略： 基因修正 基因置換 基因激活 基因增補(bǔ) 基因干擾 免疫調(diào)節(jié) 藥物敏感療法,基因治療的策略,（一）基因修正 通過特定的方法如同源重組或靶向突變等對(duì)突變的DNA進(jìn)行原位修復(fù),將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。 但目前在技術(shù)上還無法做到。因?yàn)橐谌嘶蚪M的某個(gè)特異部位上進(jìn)行重組是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。然而原位修復(fù)的方法無疑是進(jìn)行基因治療最理想的途徑和目的。,基因治療的策略,（二）基因置換 基因置換指去除整個(gè)變異基因，用有功能的正?；蛉〈?，使致病基因得到永久地

6、更正。傳統(tǒng)上所謂基因治療實(shí)際上就是指基因替代療法，就像外科移植手術(shù)一樣。,基因治療的策略,（三）基因激活 有些正?；虿荒鼙磉_(dá)并發(fā)生了基因突變，而是由于被錯(cuò)誤地甲基化或編碼區(qū)組蛋白去乙?；拢灰灿械氖蔷幋a區(qū)是正常的但調(diào)控區(qū)發(fā)生了突變。 前者可以通過去甲基化或乙?；够蚧謴?fù)活性；后者可以加入正常啟動(dòng)子來激活基因。 但是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)去甲基化和乙酰化也非易事；原位修復(fù)調(diào)控序列也是很難的。,基因治療的策略,（四）基因增補(bǔ) 又稱基因修飾，是指將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能修飾缺陷細(xì)胞的功能會(huì)使原有的某些功能得以加強(qiáng)。 在這種治療方法中，缺陷基因仍然存在于細(xì)胞內(nèi)，目前基因治療多采用

7、這種方式。,基因治療的策略,（五）基因干擾 又稱基因失活，有兩種干擾方法： 1、抑制有害的基因表達(dá)：導(dǎo)入腫瘤抑制基因， （如rb或p53),以抑制癌基因的異常表達(dá)。 2、封閉有害基因：用反義RNA或小分子干擾RNA來瘋幣癌基因，同樣不能恢復(fù)癌基因的正常功能，但可用來抑制病原體的關(guān)鍵基因。,基因治療的策略,（六）免疫調(diào)節(jié) 將抗體、抗原或細(xì)胞因子的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，改變患者的免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。 如將白細(xì)胞介素-2導(dǎo)入腫瘤患者體內(nèi)，提高患者IL-2的水平，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性，達(dá)到防治腫瘤復(fù)發(fā)的目的。,基因治療的策略,（七）藥物敏感療法 應(yīng)用藥物敏感基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，以提高

8、腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。 如向腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后給予患者無毒性的環(huán)氧鳥苷藥物。腫瘤細(xì)胞被殺死，而對(duì)正常細(xì)胞無影響。,基因治療的策略,一些常見疾病的基因治療策略：,基因治療的方式,1. 直接體內(nèi)療法（in vivo） 是指將目的基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。 2. 間接體內(nèi)療法（ex vivo） 是指在體外將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過篩選和增殖后將細(xì)胞回輸給患者，使該基因在體內(nèi)有效地表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。,基因治療的方式,直接體內(nèi)療法（in vivo） 、利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，要求靶細(xì)胞處于分裂期，但許多需進(jìn)行基因治療的組織多處于靜

9、止期 、目前用溫和病毒載體直接注入相應(yīng)的組織,基因治療的方式,間接體內(nèi)療法（ex vivo） 、從患者體內(nèi)取出帶有缺陷基因的細(xì)胞，并培養(yǎng)； 、將帶有目的基因的載體通過轉(zhuǎn)染或感染轉(zhuǎn)移到培 養(yǎng)的靶細(xì)胞中，進(jìn)行遺傳修正 、對(duì)遺傳修正的細(xì)胞進(jìn)行選擇和培養(yǎng)； 、處理過的細(xì)胞用融合或移植的方法轉(zhuǎn)入患者體內(nèi),Company Logo,基因治療的方式,ex vivo,將目的基因直接輸入體內(nèi),in vivo,將目的基因?qū)牖颊甙屑?xì)胞,體外培養(yǎng),將重組靶細(xì)胞回輸體內(nèi),靶細(xì)胞,基因治療的方式,基因治療的關(guān)鍵步驟： 1、目的基因的選擇 2、靶細(xì)胞的選擇 3、選擇安全而有效的方法和載體系統(tǒng)，使外源基因順利地導(dǎo)入靶細(xì)胞，

10、并有效表達(dá)從而達(dá)到治療目的。,基因治療的方式,目的基因的選擇是根據(jù)不同的疾病、不同的治療方式而定的,基因治療的方式,靶細(xì)胞的選擇需考慮： 1、最好為組織特異性細(xì)胞 2、細(xì)胞易獲得，具有增殖優(yōu)勢，生命周期長 3、離體細(xì)胞較易受外源基因轉(zhuǎn)化 4、細(xì)胞堅(jiān)固，能耐受處理，回植到體內(nèi)易成活,基因治療的方式,常用的靶細(xì)胞有： 造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。,Company Logo,基因治療的方式,目的基因的轉(zhuǎn)移方式： 1.直接注射法 2.磷酸鈣沉淀法 3.顯微注射法 4.脂質(zhì)體介導(dǎo)法 5.受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 6.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基

11、因轉(zhuǎn)移,直接注射法,將目的基因直接注射到體內(nèi)的某些部位(如肌肉)，鄰近細(xì)胞攝人DNA并表達(dá)。這種方法非常簡單，但效率低。,Company Logo,磷酸鈣沉淀法,將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，即有磷酸鈣微沉淀形成，體外培養(yǎng)的細(xì)胞可將沉淀吞入細(xì)胞內(nèi)，從而將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。這種方法優(yōu)點(diǎn)在于簡單和通用性，但轉(zhuǎn)化效率通常很低。,Company Logo,顯微注射法,在顯微鏡下，直接將DNA由細(xì)胞玻璃針注人細(xì)胞核內(nèi)，可避免DNA的降解，但要求有熟練的操作技巧。,脂質(zhì)體介導(dǎo)法,將目的基因包裹到脂質(zhì)體內(nèi)，通過靜脈注人體內(nèi)，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合而使目的基因進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移能在活體內(nèi)應(yīng)用

12、，較為簡單，轉(zhuǎn)移效率較低，轉(zhuǎn)移的目的基因不與染色體整合，只能短時(shí)間表達(dá)。,受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,將含有目的基因的重組質(zhì)粒DNA共價(jià)連接到能與某種細(xì)胞受體結(jié)合的配體上，再將這種復(fù)合物注人體內(nèi)，配體與細(xì)胞受體特異性結(jié)合，發(fā)生正常的人胞作用，目的基因從而進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)。這種方式轉(zhuǎn)人的目的基因也不與染色體整合，只能短時(shí)間表達(dá)。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,帶有外源性基因的重組病毒在感染細(xì)胞時(shí).可將外源性基因序列導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)。目前主要使用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒可將遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，因而很合適作基因治療載體。將野生的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行重組，除去編碼病毒自身蛋白的序列，插人目的基因。,基因治療的問題,安全性問題 1999年首例基因治療失敗事件 只限于體細(xì)胞，提倡間接體內(nèi)法、主要用于單基因遺傳病治療、療效顯著并經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等。,社會(huì)倫理問題 禁止用于生殖細(xì)胞 防止不當(dāng)應(yīng)用（如體育上）,目前，基因治療領(lǐng)域存在的主要問題是有效性和安全性。事實(shí)上，自1995 年以來，全世界基因治療領(lǐng)域的科學(xué)家們?cè)诟纳苹驅(qū)胂到y(tǒng)和載體方面作了大量的努力，新思路、新技術(shù)和新方法層出不