1、,免疫學(xué)檢驗,第二十一章化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù),1.化學(xué)發(fā)光劑的概念及常用的化學(xué)發(fā)光劑。 2.化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術(shù)類 型。 3.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技 術(shù)。 4.電化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理。 5.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用。,本章要點,目錄,化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的抗原抗體反應(yīng)技術(shù)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、維生素和藥物等的檢測分析技術(shù)。該技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、分離簡便、 快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動化分析等特點，在免疫學(xué)檢驗中應(yīng)用廣泛。,前 言,放射免疫技術(shù),酶免疫技術(shù),熒光免疫技術(shù),金免疫技術(shù),化學(xué)發(fā)光

2、免疫技術(shù),標記免疫技術(shù),第一節(jié) 基本知識,一、發(fā)光,發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由低能級的基態(tài)躍遷到高能級的激發(fā)態(tài)，然后再返回到基態(tài)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)的激發(fā)能不同可將發(fā)光分為光照發(fā)光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光。,1.光照發(fā)光（photoluminescence）,發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。,2.生物發(fā)光（bioluminescence）,發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用atp產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來。

3、,3.化學(xué)發(fā)光,某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。,一個化學(xué)反應(yīng)要產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件：,該反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能, 并由某一步驟單獨提供, 因為前一步反應(yīng)釋放的能量將因振動弛豫消失在溶液中而不能發(fā)光,要有有利的反應(yīng)過程, 使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)分子必須具有一定的化學(xué)發(fā)光量子效率釋放出光子, 或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個分子使之進入激發(fā)態(tài)并釋放出光子,在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以

4、發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。,二.化學(xué)發(fā)光劑,作為化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個條件：,發(fā)光的量子產(chǎn)率高,物理-化學(xué)特性要與被標記或測定的物質(zhì)相匹配,能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物,其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果,在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性,常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物有 1.直接化學(xué)發(fā)光劑 2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物 3.電化學(xué)發(fā)光劑,1.直接化學(xué)發(fā)光劑,在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。如常用的吖啶酯（acridinium，ae） 。,吖啶酯在堿性條件下被h2o2

5、氧化時,發(fā)出波長 為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā) 態(tài)產(chǎn)物n-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。,2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物,是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光。 目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過氧 化物酶（hrp）和堿性磷酸酶（alp）。hrp的常用 的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物，alp的發(fā)光底物 為金剛烷（amppd）,（1）魯米諾或其衍生物,魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發(fā)生化 學(xué)發(fā)光反應(yīng)，輻射出最大發(fā)射波長為425nm的光。,魯米諾增強發(fā)光反應(yīng)原理,（2）amppd,3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷,

6、3電化學(xué)發(fā)光劑,電化學(xué)發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光的物質(zhì)。如化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕ru(bpy)32+和電子供體三丙胺（tpa）在陽性電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。,用化學(xué)發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相應(yīng)的抗原(抗體)和磁顆粒性的抗體（抗原）發(fā)生免疫反應(yīng)后，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標記物分離開來，這時只需加入氧化劑（h2o2）和naoh使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，可從標準曲線上計算出待測抗原(抗體)的含量,第二節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫分析,一、 檢測原理,

7、化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖,1.分離方法 常用磁顆粒分離技術(shù)，即用抗原或抗體包被磁顆粒，與標本中相應(yīng)抗體或抗原及吖啶酯標記的抗體或 抗原通過一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后,最終通過在磁場 中沖洗將結(jié)合到免疫復(fù)合物中的標記物和游離標記物 進行分離的技術(shù)。,二、方法類型,2.常用的免疫學(xué)反應(yīng)模式,雙抗原夾心法,固相抗原競爭法,雙抗體夾心法,三、技術(shù)要點,抗原抗體結(jié)合反應(yīng),結(jié)合物與游離物的分離 (磁顆粒分離技術(shù)),化學(xué)發(fā)光反應(yīng),化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（cleia）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（hrp）或堿性磷酸酶(alp)來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應(yīng)的抗體(抗原)發(fā)生免疫

8、反應(yīng)后，經(jīng)洗滌將結(jié)合物與游離的酶標物分離后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。,第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析,一、 檢測原理,堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光酶免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖,1.根據(jù)標記酶不同分類 可分為辣根過氧化物酶標記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和堿性磷酸酶標記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析。前者常以魯米諾或其衍生物作為發(fā)光底物，后者常以amppd作為發(fā)光底物。 2. 根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分類 同化學(xué)發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法等主要模式，所不同只是

9、相應(yīng)抗原或抗體上標記的是酶而不是直接標記發(fā)光劑。,二、方法類型,三、技術(shù)要點,抗原抗體結(jié)合反應(yīng),結(jié)合物與游離物的分離 （磁顆粒分離法 、微粒子捕獲法 、包被聚苯乙烯反應(yīng)珠或孔分離法 ）,酶促發(fā)光反應(yīng),電化學(xué)發(fā)光免疫分析（eclia）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體(抗原)，通過抗原抗體反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的抗原或抗體進行定量分析，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。,第四節(jié) 電化學(xué)發(fā)光免疫分析,一、 檢測原理,電化學(xué)發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖,電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖,1.分離方法 常用磁顆粒分離技術(shù) 2.免疫學(xué)反應(yīng)模式 其反應(yīng)模式同發(fā)光免疫分析，

10、主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法三種主要模式，所不同只是相應(yīng)抗原或抗體上標記的是三聯(lián)吡啶釕。,二、方法類型,三、技術(shù)要點,抗原抗體反應(yīng),結(jié)合物與游離物的分離 (磁顆粒分離技術(shù)),電化學(xué)發(fā)光過程,第五節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用,一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的特點,1.敏感度高，甚至超過ria； 2.精密度和準確性均可與ria相比； 3.試劑穩(wěn)定，無毒害； 4.測定耗時短； 5.測定項目多； 6.已發(fā)展成自動化測定系統(tǒng)。,1.甲狀腺激素 t3、t4、htsh、ft4、ft3、抗tpo、甲狀腺球蛋白、抗甲狀腺球蛋白抗體等。 2.生殖激素 -hcg、催乳素、促卵泡激素、促黃 體激素、孕酮、

11、雌二醇、非結(jié)合雌三醇、甲胎蛋白、睪丸酮、硫酸脫氫異雄酮。 3.腎上腺/垂體激素 皮質(zhì)醇、尿皮質(zhì)醇、人生長激 素、甲狀旁腺素、促腎上腺皮質(zhì)激素。,二、 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測項目,4.貧血因子 維生素b12、葉酸、紅細胞葉酸、鐵蛋 白等。 5.腫瘤標記物 afp、cea、psa、游離psa、cal9-9、cal25、cal5-3等。 6感染性疾病 衣原體抗原、尿衣原體抗原、衣原 體抗原確認、弓形體igg抗體、弓形體igm抗體、風(fēng) 疹病毒igg抗體、風(fēng)疹病毒igm抗體、巨細胞病毒igg 抗體、巨細胞病毒igm抗體等。,二、 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測項目,7糖尿病 胰島素、c肽等。 8心血管系統(tǒng) 肌酸激酶mb同工酶、地高辛、肌紅 蛋白、心肌肌鈣蛋白-i等。 9病毒標記物 hivl/2ab、hbsag、hbsag確認、 hbsab、hcvab、hav igm、havab、hbcab、hbclgm、hbeag、hbeab等。,二、 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)常見的檢測項目,10骨代謝 骨膠原酶、脫氧吡啶啉等。 11過敏