1、2014-3-21,1,制作者：白慧,大家好！,2014-3-21,2,免疫組化圖片,2014-3-21,3,免疫熒光圖片,2014-3-21,4,免疫組化與免疫熒光,免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素等) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法；這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測(cè)或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測(cè)或定位抗體，但是在實(shí)際

2、工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。,2014-3-21,5,實(shí)驗(yàn)原理,免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記的顯色劑 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原；免疫熒光技術(shù)是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。,2014-3-21,6,實(shí)驗(yàn)步驟,脫蠟水化： 二甲苯 20min 二甲苯 20min 無水乙醇 10min 無

3、水乙醇 10min 95%乙醇 5min 80%乙醇 5min 75%乙醇 5min 50%乙醇 過一遍 蒸餾水 過三遍 高壓修復(fù) 4min 流水冷卻 PBS沖洗 5min3次,3%H2O2 15 min，37 /(0.5%Triton 5min) PBS沖洗 5min3次 10%山羊血清封閉 37，50min 一抗 4 ,過夜 復(fù)溫 37 ，1h PBS 沖洗 5 min x3 次 二抗 30 min PBS 沖洗 5 min x3 次DAB顯色 1min /(DAPI 5min)PBS沖洗 (蓋片，觀察。) 蘇木素復(fù)染 1min 自來水沖洗 脫水，透明，封片。,2014-3-21,7,抗原

4、修復(fù)原因 *常規(guī)的石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，結(jié)果使得： -抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇； -蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。 *要求：在染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。 方法：微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。,2014-3-21,8,注意事項(xiàng),標(biāo)本固定 脫水、石蠟包埋和制片 脫蠟和水化 抗原修復(fù) 細(xì)胞通透 滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素 血清封閉 一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間 抗體稀釋液 切片清洗 DAB顯色 避光 復(fù)染 封片,防止

5、標(biāo)本從玻片上脫落； 除去妨礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果； 固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛,脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對(duì)組織要完全浸蠟、切片時(shí)刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。,為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。,由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。,使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton X-100、

6、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。,滅活內(nèi)源性POD一般3%過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右，而0.3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長封閉時(shí)間，一般1030min；過氧化氫孵育時(shí)間過長易引起脫片,組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；但不能與一抗來源一致。一般室溫10-30min。,一抗孵育條件在免疫組化反

7、應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有：4、室溫、37，其中4效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般371-2h，而4過夜和從冰箱拿出后37復(fù)溫45min較好。二抗一般室溫或3730min-1h。,抗體稀釋液用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對(duì)抗體的多次回收利用較好。正因?yàn)檫@種原因，抗體稀釋液的PH值可能偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。,為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均

8、為5次*5min。 注意：單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。 溫柔沖洗，防止切片的脫落?？捎媒捶绞?； 沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。 PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。,背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗.,防止熒光素提前衰退。,目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染。蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時(shí)間長一點(diǎn)，而胞核蛋白則要短。,一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液

9、，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止,2014-3-21,9,石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象,1）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時(shí)間和提高烤片溫度；2）用含有多聚賴氨酸的玻片；3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；4）用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。,2014-3-21,10,免疫組化常見問題的處理,標(biāo)本無染色 確認(rèn)是否忽略了應(yīng)該加的某種試劑(一抗、二抗、三抗及底物等)。 確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時(shí)間。 對(duì)照抗體的標(biāo)簽確認(rèn)

10、是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測(cè)系統(tǒng)是否和一抗匹配。 檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。 檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在48條件下保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融，試劑保存時(shí)一定要避免與揮發(fā)性有機(jī)溶劑同放一室，以免降低抗體的效價(jià)。 檢查標(biāo)本的儲(chǔ)存條件，最好用已知陽性的標(biāo)本來同時(shí)做陽性對(duì)照。 檢查沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉。 檢查復(fù)染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。,2014-3-21,11,弱陽性, 標(biāo)本的固定方式，不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r(shí)溫度過高，都會(huì)影響到所檢測(cè)的抗原的數(shù)量和質(zhì)

11、量。 不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對(duì)抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復(fù)或酶消化或兩種同時(shí)使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應(yīng)參照生產(chǎn)廠家的說明，同時(shí)結(jié)合標(biāo)本的具體情況而定。 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時(shí)間是否正確。一般試劑生產(chǎn)廠家都會(huì)對(duì)試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標(biāo)本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用范圍，對(duì)所使用的一抗進(jìn)行梯度測(cè)試，找出最佳的使用濃度。 切片上遺留了過多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時(shí)，等于人為地對(duì)抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋。 孵育時(shí)切片是否放置水平，否則會(huì)導(dǎo)致抗體流失。如果陰性對(duì)照沒有反應(yīng)，陽性對(duì)照反應(yīng)良好，而標(biāo)本弱

12、陽性，則可能是由于陽性對(duì)照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。,2014-3-21,12,產(chǎn)生組織切片非特異性染色,1）抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。 2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，可試用單克隆抗體；3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；4）非特異性組分與抗體結(jié)合，通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；5）DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高；6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗孵育之后

13、的浸洗要充分；7）標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。,2014-3-21,13,免疫熒光常見問題的處理,非特異性染色產(chǎn)生原因及其解決方案： 游離熒光素殘留在二抗中。購買高質(zhì)量、高純度的熒光素二抗。 抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。 組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原，可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。延長血清封閉時(shí)間。 從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。 抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。 熒光素不純、標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?一抗和二抗孵育條件和濃度不合適。調(diào)整一抗和二抗孵育條件和濃度至最佳。 一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長清洗時(shí)間。,