1、端粒與端粒酶 陳莉 南通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,早在30年代，兩名遺傳學(xué)家Muller和Mcclintock分別在不同的實(shí)驗(yàn)室用不同的生物做實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染色體末端結(jié)構(gòu)對(duì)保持染色體的穩(wěn)定十分重要，Muller將這一結(jié)構(gòu)命名為端粒（telomere）。直到1985年Greider等從四膜蟲(chóng)中真正證實(shí)了端粒的結(jié)構(gòu)為極簡(jiǎn)單的6個(gè)核苷酸TTAGGG序列的多次重復(fù)后發(fā)現(xiàn)了端粒酶(telomerase TRAP-eze) 。,端粒與端粒酶是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。 端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的核酸蛋白復(fù)合體,其功能在于維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。 端粒酶是一種核酸核蛋白酶,能以自身的RNA為模板合成端粒的重復(fù)序列,以維

2、持端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)定性。 許多研究表明,端粒、端粒酶的功能失調(diào)將影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括細(xì)胞周期的穩(wěn)定性、細(xì)胞增殖、癌變、凋亡、衰老。,第一節(jié) 端粒與端粒酶 一、端粒的結(jié)構(gòu)與功能 1972年James Watson提出了“復(fù)制末端問(wèn)題”，復(fù)制DNA的DNA多聚酶并不能將線性染色體末端的DNA完全復(fù)制。也就是說(shuō)在線性DNA復(fù)制時(shí)，DNA多聚酶留下染色體末端一段DNA（一段端粒）不復(fù)制。 端粒DNA復(fù)制的特點(diǎn)是在每次DNA 復(fù)制中，每條染色體的3端均有一段DNA無(wú)法得到復(fù)制，隨著細(xì)胞每次分裂，染色體3一末端將持續(xù)喪失50-200bp的DNA，因而細(xì)胞分裂具有一定的限度，即分裂壽命。所以端粒的長(zhǎng)度可作

3、為細(xì)胞的“分裂時(shí)鐘”，反映細(xì)胞分裂能力。,真核細(xì)胞染色體末端會(huì)隨著細(xì)胞分裂而縮短，這個(gè)縮短的端粒再傳給子細(xì)胞后，隨細(xì)胞的再次分裂進(jìn)一步縮短。隨著每次細(xì)胞分裂，染色體末端逐漸縮短，直至細(xì)胞衰老。人類(lèi)體細(xì)胞遵循這個(gè)規(guī)則從細(xì)胞出生到衰老，單細(xì)胞生物遵循這個(gè)規(guī)則分裂后定有其它機(jī)制保持單細(xì)胞生物傳代存活，生殖細(xì)胞亦如此。,端粒：是真核細(xì)胞線性染色體末端特殊結(jié)構(gòu)。 由端粒DNA和端粒相關(guān)蛋白組成。 端粒DNA：為不含功能基因的簡(jiǎn)單、高度重復(fù)序列, 在生物進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性。 不同物種的端粒DNA 序列存在差異。 人類(lèi)及其它脊椎動(dòng)物染色體端粒的結(jié)構(gòu)是5TTAGGG3的重復(fù)序列, 長(zhǎng)約15kb。體細(xì)胞的

4、端粒有限長(zhǎng)度（telomere restriction fragments TRFS）大多數(shù)明顯短于生殖細(xì)胞，青年人的TRFs又顯著長(zhǎng)于年長(zhǎng)者，提示TRFs隨著細(xì)胞分裂或衰老，在不斷變短，主要是由于DNA聚合酶不能完成復(fù)制成線性DNA末端所致。,端粒DNA由兩條互相配對(duì)的DNA 單鏈組成, 其雙鏈部分通過(guò)與端粒結(jié)合蛋白質(zhì)TRF1和TRF2 結(jié)合共同組成t環(huán)(t loops)。這種t 環(huán)特殊結(jié)構(gòu)可維持染色體末端的穩(wěn)定,保持染色體及其內(nèi)部基因的完整性,從而使遺傳物質(zhì)得以完整復(fù)制。缺少端粒的染色體不能穩(wěn)定存在。 端粒DNA與結(jié)構(gòu)蛋白形成的復(fù)合物如同染色體的一頂“帽子”，它既可保護(hù)染色體不被降解，又避

5、免了端粒對(duì)端融合（end-end fusion）以及染色體的喪失，同時(shí)端粒能幫助細(xì)胞識(shí)別完整染色體和受損染色體。在生理情況下，端粒作為細(xì)胞“分裂時(shí)鐘”能縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞脫離細(xì)胞周期。,二、端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能 在端粒被發(fā)現(xiàn)以前，人們就推測(cè)生殖細(xì)胞之所以能世代相傳，其中可能存在一種維持端粒長(zhǎng)度的特殊機(jī)制，體細(xì)胞可能正是由于缺乏這種機(jī)制，它的染色體末端才面臨著致死性缺失（deletion）的危險(xiǎn)。因此在正常人體細(xì)胞間永生化細(xì)胞（immortalized cells）及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能也存在著與生殖細(xì)胞類(lèi)似的機(jī)制。這些細(xì)胞怎樣保持細(xì)胞具有繼續(xù)分裂或長(zhǎng)期分裂的能力呢？科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)端粒確實(shí)隨著每

6、次分裂而縮短，但也會(huì)被新合成的端粒片斷再延長(zhǎng)?？茖W(xué)家們懷疑，可能尚有末被發(fā)現(xiàn)的酶，該酶具有標(biāo)準(zhǔn)的DNA多聚酶所不具備的功能，能使已縮短的端粒延長(zhǎng)，使科學(xué)家們興奮的是到1984年首先在四膜蟲(chóng)中證實(shí)了這種能使端粒延長(zhǎng)的酶端粒酶的存在。, 端粒酶的結(jié)構(gòu) 端粒酶在結(jié)構(gòu)上為一核糖核蛋白復(fù)合體,由RNA 和結(jié)合的蛋白質(zhì)組成,是RNA依賴的DNA 聚合酶。它是一種特殊的能合成端粒DNA的酶,通過(guò)明顯的模板依賴方式每次添加一個(gè)核苷酸。 端粒酶實(shí)質(zhì)上是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶 端粒酶RNA(hTR) 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT） 端粒酶結(jié)合蛋白（TEP）,端粒酶RNA(hTR),端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）,端粒酶結(jié)合蛋

7、白（TEP）,端粒酶RNA是第一個(gè)被克隆的端粒酶組分。端粒酶RNA含有與同源端粒DNA序列TTAGGG的互補(bǔ)序列,核糖核酸酶H切割此模板區(qū),能使體外消除端粒酶延長(zhǎng)端粒的功能。,人類(lèi)TERT（hTERT）基因?yàn)橐粏慰截惢?定位于5p15. 33 ,具有7個(gè)保守序列結(jié)構(gòu)域單元和端粒酶特異性結(jié)構(gòu)域單元T。破壞TERT 將消除端粒酶活性并致端?？s短。,TEP1、生存動(dòng)力神經(jīng)細(xì)胞基因(SMN) 產(chǎn)物、 hsp90 、 PinX1、 Est1p 和Est3p,1、端粒酶RNA(hTERT) 哺乳動(dòng)物端粒酶RNAs(hTR和mTR)在許多組織的不同發(fā)育階段,甚至那些沒(méi)有端粒酶活性的組織中廣泛表達(dá)。 體內(nèi)端

8、粒酶RNA 的存在對(duì)端粒酶功能至關(guān)重要，影響到端粒酶RNA 的穩(wěn)定性與突變,也可改變體內(nèi)端粒長(zhǎng)度，并可通過(guò)改變端粒完整性或端粒結(jié)合因子的末端結(jié)合位點(diǎn)致細(xì)胞核分裂后期細(xì)胞死亡 。 端粒酶RNA轉(zhuǎn)錄模板 遠(yuǎn)端區(qū)參與和底物的結(jié)合。 近端區(qū)能添加特定的核苷酸,對(duì)底物識(shí)別并不重要。模板邊界區(qū)與端粒酶催化亞基TERT結(jié)合,也與端粒酶相關(guān)因子Est1p和Ku 結(jié)合。,2、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT) 幾乎所有存在端粒酶的機(jī)體均含有一單獨(dú)的TERT 基因, 哺乳動(dòng)物TERT 的轉(zhuǎn)錄由許多轉(zhuǎn)錄因子、激素和細(xì)胞外信號(hào)嚴(yán)格控制。不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)hTE

9、RT在不同的細(xì)胞內(nèi)含物中的表達(dá)。癌基因c-myc是一個(gè)受特殊信號(hào)調(diào)節(jié)的可誘導(dǎo)癌基因, 并可與HRas、NRas、多瘤病毒MT、LT 等癌基因協(xié)同作用, 促進(jìn)細(xì)胞無(wú)限增殖, 獲得永生化并發(fā)生癌變。,c-myc 與hTERT Fujimoto等用c-myc 反義寡核甘酸轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞后, 這些細(xì)胞中端粒酶活性均能被下調(diào), 而c-myc 正義寡核甘酸無(wú)此作用。 Wang等研究發(fā)現(xiàn)c-myc在正常人乳腺上皮細(xì)胞和二倍體成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)端粒酶活性, 并能延長(zhǎng)這些細(xì)胞的壽命。因此認(rèn)為癌基因c-myc為一重要的端粒酶激活劑。 存在于hTERT核心啟動(dòng)子中有兩個(gè)重要的c-myc 結(jié)合位點(diǎn)(CACGTG,亦被稱

10、為E 盒)。c-myc 誘導(dǎo)的hTERT 表達(dá)起始速度快,不受細(xì)胞增殖或額外的蛋白合成的影響,與c-myc 引起的直接的轉(zhuǎn)錄激活一致。但癌基因c-myc 不是唯一與hTERT基因調(diào)節(jié)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。,近期研究表明,Sp1 協(xié)同c-myc 激活hTERT的轉(zhuǎn)錄,可能還有其他因子,如Bcl-2 抗凋亡基因、E6HPV16 型蛋白，以及經(jīng)過(guò)一些蛋白激酶的磷酸化使hTERT 上調(diào)。但在諸多不同類(lèi)型的瘤細(xì)胞中,致hTERT上調(diào)的基本激活劑是c-myc。 TERT內(nèi)的N-殘基對(duì)多種功能是重要的, 包括與端粒酶RNA結(jié)合、端粒酶RNA 裝配和催化作用、與p53 的相互作用和細(xì)胞永生化。 TERT的C-殘基也

11、在人類(lèi)原始纖維母細(xì)胞的永生化、端粒組裝的競(jìng)爭(zhēng)、核仁內(nèi)定位、引物結(jié)合和漸進(jìn)性延長(zhǎng)等方面起重要作用。,3、端粒酶相關(guān)蛋白(TEP) 端粒酶相關(guān)蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA 結(jié)合蛋白，TEP1 缺失導(dǎo)致rRNA 水平的顯著降低以及TEP1 和rRNA 的丟失,但不導(dǎo)致端粒酶活性或端粒長(zhǎng)度的紊亂。 生存動(dòng)力神經(jīng)細(xì)胞基因(SMN) 產(chǎn)物 熱休克蛋白（hsp）90 、其他涉及到TERT轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白包括磷酸酶-A、Akt 、cAbl 、p53 和PARP。 PinX1 與人TERT體外共表達(dá)時(shí)抑制人端粒酶活性。 芽殖酵母蛋白Est1p 和Est3p 這兩個(gè)蛋白與體內(nèi)端粒酶的功能有關(guān)。Est1p

12、 足以使端粒延長(zhǎng)。但是,在無(wú)Est1p存在的情況下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以維持端粒長(zhǎng)度。, 端粒酶的功能 端粒酶是在染色體末端不斷合成端粒序列的酶，它可以維持端粒的長(zhǎng)度，維持細(xì)胞增殖潛能。端粒酶以自身RNA為模板合成端粒酶重復(fù)序列，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它的活性不依賴于DNA聚合酶，對(duì)RNA酶、蛋白酶和高溫均敏感。端粒酶活性表達(dá)能穩(wěn)定端粒的長(zhǎng)度，抑制細(xì)胞的衰老，在生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中可檢測(cè)到高水平的端粒酶活性。 在體內(nèi)還不清楚每一次細(xì)胞分裂有多少端粒DNA合成。體內(nèi)端粒酶的延長(zhǎng)功能是一復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程:受雙鏈端粒結(jié)合蛋白包括RAP1 (芽殖酵母) 、存在于t環(huán)的TRF1 (依賴于端粒酶

13、)和TRF2(不依賴于端粒酶)的負(fù)調(diào)控。,第二節(jié) 端粒端粒酶對(duì)細(xì)胞死亡和細(xì)胞永生化的影響 “端粒端粒酶假說(shuō)”認(rèn)為端粒酶的激活與細(xì)胞永生化和惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。染色體末端的端粒DNA進(jìn)行性的縮短是限制人細(xì)胞壽命的先決條件。相對(duì)地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被認(rèn)為是細(xì)胞永生化和癌癥發(fā)展必需的一步。目前的資料證實(shí),端粒酶對(duì)長(zhǎng)期成活的組織和長(zhǎng)期進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞是必需的。,細(xì)胞的死亡過(guò)程分為兩個(gè)階段, 當(dāng)端?？s短至一關(guān)鍵性長(zhǎng)度2kb-4kb 時(shí),染色體的穩(wěn)定性就會(huì)遭到破壞,細(xì)胞開(kāi)始衰老進(jìn)入M1期（mortality stage1 M1）。在M1期細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子等失去反應(yīng)，產(chǎn)生DNA合成蛋

14、白抑制因子，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)（cell cycle checkpoints）發(fā)送周期停止信號(hào)，DNA合成停止，DNA 斷裂,活化p53 依賴或非p53 依賴的DNA 損傷途徑。并誘導(dǎo)細(xì)胞周期依賴性激酶（CDK）抑制物如p21 ,p27產(chǎn)生,導(dǎo)致細(xì)胞G1期生長(zhǎng)停滯,最終走向死亡。如果這一過(guò)程中一些癌基因SV40T抗原、PRB ,p53 ,p16 等抑癌基因失活,喪失正常功能, 均能使M1期的機(jī)制被抑制使細(xì)胞逃逸M1期，繼續(xù)生長(zhǎng)獲得額外的增殖能力，此時(shí)端粒酶仍為陰性，端粒繼續(xù)縮短，經(jīng)過(guò)20-30次分裂后，最終到達(dá)M2期。細(xì)胞由于端粒過(guò)短,基因不穩(wěn)定,絕大多數(shù)細(xì)胞死亡,只有極少數(shù)細(xì)胞由于端粒酶活性的上

15、調(diào)或重新激活,端粒的功能得到恢復(fù),基因重獲穩(wěn)定,使細(xì)胞超越M2期,成為永生化細(xì)胞。,端粒酶被抑制 正常人體細(xì)胞 端粒丟失 M1期阻滯 SV40T抗原 細(xì)胞分裂停止 Rb、P53與病毒蛋白結(jié)合、突變 M1M2期間隔 永生化 雙著絲粒形成 M2期退化 染色體失穩(wěn) 端粒酶被激活 細(xì)胞凋亡,端粒酶在人體細(xì)胞永生性轉(zhuǎn)化中,第三節(jié) 端粒酶細(xì)胞周期中細(xì)胞增殖、凋亡的影響 一、端粒酶對(duì)細(xì)胞周期的影響 端粒酶活性與細(xì)胞周期密切相關(guān)。細(xì)胞周期所處階段不同,端粒酶活性亦不同, 端粒酶活性與細(xì)胞周期CDK-CKIs 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)有關(guān) 。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)永生化細(xì)胞株在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相都有端粒酶活性,而靜息細(xì)胞中活性降低,隨著腫

16、瘤細(xì)胞進(jìn)入G1/S 期,端粒酶活性逐漸升高,在復(fù)制S 期端粒酶活性最高,而在G2/M期端粒酶活性逐漸喪失,當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞處于無(wú)血清而進(jìn)入G0 期時(shí),端粒酶活性不受影響。在人乳腺癌中,端粒酶的高活性水平伴有cylinD 或cyclin E 的高表達(dá),某些周期蛋白可能參與端粒酶活性的調(diào)控。,各種基因毒性或環(huán)境應(yīng)激所致細(xì)胞DNA雙鏈破壞時(shí)可使野生型p53活化, 進(jìn)而引起細(xì)胞周期停滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 使細(xì)胞得以避免表型惡性轉(zhuǎn)化。端粒雙鏈DNA 的破壞是否也能活化p53依賴的信號(hào)傳導(dǎo)通路呢?kusumoto等在構(gòu)建的端粒酶和p53單或雙缺陷鼠體內(nèi)研究證實(shí), 端粒DNA的丟失可以誘導(dǎo)活化p53和p21WAF1

17、, 并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，而p53的缺失則可促進(jìn)端粒序列的丟失, 增大染色體的融合頻率。端粒功能的缺失以及相繼出現(xiàn)的基因不穩(wěn)定與p 53缺陷相協(xié)同而激活細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程。,二、端粒酶對(duì)細(xì)胞增殖的影響 曾一度認(rèn)為端粒酶活性是細(xì)胞惡變或永生的標(biāo)志,然而,不但在正常組織的永生化細(xì)胞(如造血干細(xì)胞、精子) ,而且在非永生的、正常生理狀態(tài)下增殖活躍的細(xì)胞(如受抗原刺激的T及B淋巴細(xì)胞、口腔和食道粘膜上皮、皮膚基底層角質(zhì)形成細(xì)胞、宮頸上皮、小腸上皮) 也可檢出端粒酶活性。但Lehner 等用定量RT-PCR 法在子宮內(nèi)膜癌、增生期子宮內(nèi)膜、分泌期子宮內(nèi)膜及萎縮性子宮內(nèi)膜檢測(cè)到hTERT mRNA 表達(dá)值差異

18、顯著?？梢?jiàn),不同增殖程度的子宮內(nèi)膜均表達(dá)端粒酶活性,但其程度不同。因此,借助端粒酶定性檢測(cè)判斷良惡性增殖,其意義明顯不如定量檢測(cè)。,已有多次報(bào)道:改變實(shí)驗(yàn)條件可使多種端粒酶活性陰性細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性,并獲得永生;反之,抑制某些增殖活躍組織的端粒酶活性能抑制細(xì)胞增殖。 另有人發(fā)現(xiàn):端粒酶通過(guò)調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度和生長(zhǎng)促進(jìn)因子基因表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞增殖 。提示端粒酶是細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖中的重要機(jī)制。,但少數(shù)永生化的腫瘤細(xì)胞株和一些軟組織腫瘤雖然沒(méi)有端粒酶活性,但仍有較長(zhǎng)端粒,提示還存在不依賴端粒酶的端粒延長(zhǎng)機(jī)制 。 此外用識(shí)別hTR 3端不同序列的三種核酶作用于腫瘤細(xì)胞,4周內(nèi)端粒酶活性降低,端?？s短,增殖速度沒(méi)

19、有改變。 其他研究如黑素瘤細(xì)胞,8周內(nèi)端粒酶活性降低,但是傳代超過(guò)20 代后,端粒長(zhǎng)度不縮短,細(xì)胞持續(xù)增殖。說(shuō)明除了端粒、端粒酶引起細(xì)胞增殖的作用外，還有其他引起細(xì)胞的增殖機(jī)制。,三、 端粒酶對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 啟動(dòng)凋亡的某些基因位于端粒結(jié)構(gòu)附近, 完整的端粒結(jié)構(gòu)可以抑制這些基因的表達(dá), 而維持端粒長(zhǎng)度主要依賴于端粒酶。 Holt等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 通過(guò)異位表達(dá)端粒酶,而使端粒長(zhǎng)度保持穩(wěn)定的某些正常細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗力增強(qiáng)； 用實(shí)驗(yàn)方法使端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞端粒延長(zhǎng), 子代細(xì)胞生存和抗凋亡能力將增強(qiáng)；端粒酶陽(yáng)性永生化細(xì)胞要比端粒酶陰性永生化細(xì)胞有更強(qiáng)的抗凋亡生存能力。這些與兩個(gè)主要的凋亡途徑核內(nèi)鈣依賴核酸

20、內(nèi)切酶誘導(dǎo)途徑和Caspese家族中IL-1B轉(zhuǎn)換酶活化途徑存在缺陷有關(guān)。此外, 研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)hTERT 顯性突變,降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性端粒酶活性, 腫瘤細(xì)胞端粒將持續(xù)縮短, 繼之異常有絲分裂增多, 并最終出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞。,第四節(jié) 端粒酶與衰老 如何使人體衰老延遲，一直都是人類(lèi)所不斷追求的。雖然科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一些抗衰老的藥物和方法，但都不夠理想。細(xì)胞經(jīng)過(guò)一定次數(shù)分裂后，端粒的不斷丟失使細(xì)胞就進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的生長(zhǎng)抑制狀態(tài)，脫離了細(xì)胞周期而衰老、凋亡，此過(guò)程即為復(fù)制性衰老。在體外培養(yǎng)中，衰老細(xì)胞逐漸增多的過(guò)程中，可用端粒序列的逐漸丟失來(lái)作衰老量化機(jī)制精確模型。隨著年齡增長(zhǎng)，染色體中端粒長(zhǎng)度縮短。,在

21、早老患者中有一個(gè)過(guò)早的端?？s短，進(jìn)而縮短的端粒允許染色體融合，這些現(xiàn)象與年老患者的細(xì)胞中或培養(yǎng)的老化細(xì)胞中染色體組型衰老異常的高發(fā)生率密切相關(guān)。既然端粒酶活性表達(dá)能穩(wěn)定端粒的長(zhǎng)度，使端粒在細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中不會(huì)丟失，細(xì)胞衰老的進(jìn)程也能被阻止，從而壽命延長(zhǎng)這正是人們研究的端粒酶與抗衰老關(guān)系的新熱點(diǎn)。,端粒酶延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度以減慢細(xì)胞衰老最早的證據(jù)來(lái)自Bodnar等的研究，1998年其在Science上刊文報(bào)道：將人的端粒酶基因?qū)攵肆Ｃ戈幮缘恼Ｈ梭w細(xì)胞中激活其表達(dá)并培養(yǎng)細(xì)胞，然后與未導(dǎo)入該基因的細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)前者端粒明顯增長(zhǎng)，細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞壽命比后者大大延長(zhǎng)，更令人關(guān)注的是細(xì)胞并無(wú)腫瘤樣改變。Ku

22、do等報(bào)道端粒酶活性和細(xì)胞凋亡可作為伴有或不伴有子宮內(nèi)發(fā)育延遲的胎盤(pán)衰老的標(biāo)志。,Mattson等亦認(rèn)為在研究神經(jīng)細(xì)胞分化和存活中激活端粒酶與TERT功能，能較好地避免神經(jīng)細(xì)胞死亡，還可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞在各種神經(jīng)元退化性病變條件下的恢復(fù)。 阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是一種常見(jiàn)于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，其患者的腦血管壁中可分離出致AD神經(jīng)元退行性病變的-淀粉樣蛋白。 Zhu等利用反義技術(shù)和端粒酶抑制劑引發(fā)胎鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TERT的功能抑制，發(fā)現(xiàn)顯著增加了由-淀粉樣蛋白肽引起的細(xì)胞凋亡； 嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞中TERT的過(guò)量表達(dá)會(huì)降低此種細(xì)胞凋亡。,其原因是TERT

23、功能降低的神經(jīng)細(xì)胞在暴露于-淀粉蛋白中能增強(qiáng)其氧化性并使線粒體功能發(fā)生障礙，因而引起細(xì)胞凋亡。TERT在神經(jīng)退行性病變實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭姓宫F(xiàn)出有神經(jīng)保護(hù)性功能，提示在神經(jīng)細(xì)胞中若能提高端粒酶的活性可能會(huì)抑制與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性病變，如AD和腦老化的發(fā)生等。,端?？s短加快可在許多病變中觀察到:如Down 綜合征、Werner 綜合征、毛細(xì)管擴(kuò)張失調(diào)癥 、先天性角化不良等,雖然有些遺傳異常和端粒缺陷的關(guān)系還不清楚,但可能的原因有: 端粒核酸外切酶活性和(或)有效利用的增加。 端粒過(guò)度丟失。 在發(fā)育或出生后端粒補(bǔ)償機(jī)制的不足(端粒酶或正性ALT樣功能)。 端?？s短加速可由于環(huán)境的應(yīng)急介導(dǎo)的DNA 損害或?qū)?/p>

24、這些損害敏感度增加所致。不管何種原因,端?？s短速率增加可致增殖組織的早衰特征,但也促進(jìn)由于致瘤突變而獲得增殖活性提高的克隆過(guò)分生長(zhǎng)。,第五節(jié) 端粒酶活化是腫瘤的顯著特征 盡管有研究認(rèn)為端粒長(zhǎng)度維持還可以借助于非端粒酶依賴模式，即端粒替代延長(zhǎng)（altematire Lengthening of telomere ALT）機(jī)制，但其存在上并不能否認(rèn)永生化細(xì)胞中端粒酶的重要作用。自從1994年Kim等創(chuàng)立TRAP法檢測(cè)端粒酶活性以來(lái)，越來(lái)越多的文獻(xiàn)證明端粒酶活性在大多數(shù)人類(lèi)原發(fā)性腫瘤標(biāo)本及腫瘤衍生細(xì)胞系中可被檢測(cè)到。美國(guó)學(xué)者在400多例來(lái)源于12 種不同組織的原發(fā)腫瘤病例中，腫瘤組織的端粒酶陽(yáng)性率高

25、達(dá)84.8，而腫瘤周?chē)M織或良性病變中陽(yáng)性率僅為4.4。,附表 人體組織中端粒酶活性,Shay等報(bào)道了幾年不同學(xué)者對(duì)腫瘤端粒酶探討的檢測(cè)結(jié)果，總結(jié)了正常組織（196例），原位癌（410例），惡性腫瘤（2031例）和癌旁組織（690例）的端粒酶的陽(yáng)性率，它們分別是0.5%、30%、85%和11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的陽(yáng)性率為85.0%95.0%，而對(duì)應(yīng)的癌旁或良性病變組織中，端粒酶基本上不能檢出或活性極微弱。Sumida等的研究結(jié)果表明,端粒酶在各種腫瘤中的陽(yáng)性率分別為:口腔鱗狀細(xì)胞癌80 %90%,食道癌87%,胃癌85%,肺癌80.1%,肝癌85%,乳腺癌85%,

26、腎癌71%,胰腺癌95%,端粒酶陽(yáng)性率與腫瘤發(fā)生之間表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。,Orlando 等對(duì)泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤進(jìn)行了深入的流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎癌組織中端粒酶陽(yáng)性率為69%(345/497),正常腎組織為2%(7/344);膀胱癌組織中端粒酶陽(yáng)性率為90%(342/381),正常組織為27% (36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶陽(yáng)性率為65%(436/675) ,膀胱灌洗液中端粒酶陽(yáng)性率為72 %(131/182) ,而正常人為9%(47/ 486);前列腺癌組織中端粒酶陽(yáng)性率為80%(266/332),鄰近組織為38%(32/83) ,前列腺上皮瘤為16%(4/25) ,良性前列腺肥大

27、為8%(11/129) 。,85%90%的人腫瘤細(xì)胞中可以檢測(cè)到端粒酶活性,而正常細(xì)胞中卻沒(méi)有或活性很低。人們推測(cè)腫瘤細(xì)胞逃避衰老持續(xù)增殖是端粒酶激活或端粒維持機(jī)制改變的結(jié)果。 一般認(rèn)為,端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)后期事件,使腫瘤細(xì)胞的端粒不再進(jìn)行性縮短而得以維持,避免了細(xì)胞正常的復(fù)制-衰亡機(jī)制的制約而獲得永生性,這是惡性腫瘤細(xì)胞顯著的生物學(xué)特征之一,是癌變機(jī)制中一個(gè)十分重要的環(huán)節(jié)。,對(duì)細(xì)胞端粒功能的觀察和推測(cè)的最顯著的特征是發(fā)生端粒長(zhǎng)度的維持,甚至在離開(kāi)常規(guī)的激活時(shí)端粒長(zhǎng)度維持機(jī)制(TMM)的延長(zhǎng),使初期細(xì)胞突破衰老屏障后癌變。發(fā)生的原因,最可能為過(guò)度的端粒酶激活或ALT樣功能在

28、在細(xì)胞癌變中端粒長(zhǎng)度的保留或增加,允許在致瘤突變發(fā)生時(shí)異?？寺〉臄U(kuò)展。 一些端粒酶陰性的癌癥通過(guò)一種或幾種ALT途經(jīng)維持端粒的長(zhǎng)度。端粒酶或ALT機(jī)制存在于絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中以通過(guò)添加端粒重復(fù)序列而維持端粒的長(zhǎng)度。 在一些腫瘤中也觀察到一些端粒縮短的現(xiàn)象，可能的機(jī)制是由于細(xì)胞分裂的增加端粒縮短，導(dǎo)致異常修復(fù)事件使染色體發(fā)生端端融合。端端融合的后果是在隨后的細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生染色體斷裂,進(jìn)而導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定和腫瘤易感性。,美國(guó)學(xué)者在CML和AML的端粒動(dòng)力學(xué)研究中，用southern印跡法測(cè)量端粒長(zhǎng)度，用stretch-PCR法測(cè)出端粒酶活性，在CML白細(xì)胞中，端粒酶活性非常低與正常組織相似。但若

29、CML急性發(fā)作時(shí)，白細(xì)胞中端粒酶活性就表現(xiàn)為顯著升高。表明CML由慢性到急性發(fā)作時(shí)，高度激活了端粒酶。通過(guò)對(duì)CML和AML病情進(jìn)展研究，發(fā)現(xiàn)所有病例中腫瘤細(xì)胞的端粒與相應(yīng)正常細(xì)胞相比都是縮短的，這可能是由于腫瘤細(xì)胞分裂次數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞之故。,端粒危機(jī) 有些實(shí)體腫瘤細(xì)胞中端粒酶激活，但端粒并末縮短而是延長(zhǎng)出現(xiàn)了矛盾的現(xiàn)象，被稱之為端粒危機(jī)（端?？s短和端粒酶激活）。這是腫瘤細(xì)胞克隆繁衍的強(qiáng)大驅(qū)動(dòng)力，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。 端粒危機(jī)的 假說(shuō)的可能解釋為：許多血液學(xué)的惡性腫瘤都不會(huì)在局部形成腫瘤，細(xì)胞的增殖和循環(huán)都是單細(xì)胞的，因此每一個(gè)白血病細(xì)胞都將競(jìng)爭(zhēng)更有效的增殖，使突變細(xì)胞在短期內(nèi)形成群落。與此相反

30、實(shí)體腫瘤位于一點(diǎn)而不移動(dòng)，因此子代對(duì)于不同突變的競(jìng)爭(zhēng)被其緊鄰所限制。實(shí)體腫瘤中大多數(shù)成功的克隆將比白血病細(xì)胞有更穩(wěn)定的遺傳特性。因?yàn)槲挥谔厥猸h(huán)境中的特殊表型必須保持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才能克隆形成群落，所以實(shí)體腫瘤只有具備較長(zhǎng)的端粒，才能有較穩(wěn)定的遺傳特性，具備“最好”的表型從而被選擇，進(jìn)而生長(zhǎng)繁殖。,端粒酶水平與某些腫瘤惡性程度相關(guān)。采用端粒重復(fù)放大測(cè)定法(telomeric repeat amplification protocol ,TRAP) 檢測(cè)膀胱癌患者尿液中端粒酶的活性,期腫瘤患者端粒酶陽(yáng)性率為79 %(包括15 例細(xì)胞學(xué)檢測(cè)陰性患者) , 期和期腫瘤患者端粒酶陽(yáng)性率分別為84%及87.

31、5 %; 66%的膀胱炎患者端粒酶陰性,其中7 例有假陽(yáng)性;而健康者均為陰性。 對(duì)區(qū)分良性與惡性甲狀腺瘤, hTERT 是敏感的標(biāo)志物 ,從24 例患者的甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺物中提取RNA ,進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增hTERT 基因,與細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)檢查結(jié)果比較,hTERT 陽(yáng)性與惡性甲狀腺瘤的符合率為93 % ,hTERT 陰性與良性甲狀腺瘤的符合率為90 %。因此,隨著研究的不斷深入,端粒酶和hTERT有望成為腫瘤診斷及惡性程度分類(lèi)的標(biāo)志物 。,第六節(jié) 以端粒酶為靶標(biāo)的抗癌藥物研究 在85%以上的腫瘤細(xì)胞和組織中高度表達(dá)端粒酶，因此端粒酶是一個(gè)較理想的抗腫瘤藥物靶標(biāo)。 (1)使用端粒酶抑制劑后,腫

32、瘤細(xì)胞端粒縮短直至足以對(duì)增殖產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng),這種時(shí)間上的滯后與起始端粒的長(zhǎng)度有關(guān)； (2)至少在理論上腫瘤細(xì)胞存在抗端粒酶抑制劑或不依賴端粒酶的端粒維持機(jī)制的可能； (3)端粒酶抑制劑對(duì)人表達(dá)端粒酶的體細(xì)胞可能有作用,例如造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、表皮基層細(xì)胞和腸腺管細(xì)胞,但這種作用可能很小,因?yàn)樾律M織的干細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞的端粒要長(zhǎng)得多。在細(xì)胞靜止期,端粒不縮短,端粒酶幾乎沒(méi)有活性。,端粒酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和端粒酶陽(yáng)性的正常細(xì)胞的作用是不同的:腫瘤細(xì)胞對(duì)端粒酶抑制劑很敏感,作用一定時(shí)間后細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制或凋亡; 生殖細(xì)胞在端粒酶抑制劑的作用下,端粒長(zhǎng)度稍有縮短,然后繼續(xù)生長(zhǎng),端粒不再縮短; 干細(xì)胞與端粒酶陰性的細(xì)胞相比,其端?？s短的速度慢得多,經(jīng)端粒酶抑制劑作用后,干細(xì)胞中端?？s短的速度有所加快,一旦去除抑制劑,端?？s短的速度又降低。,端粒酶抑制劑的研究進(jìn)展 一、以粒酶酶RNA為靶標(biāo) 通過(guò)阻斷端粒酶RNA的