1、實(shí)驗(yàn)十二 DNA的連接與轉(zhuǎn)化,1.分子的體外連接 2的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選,一實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?當(dāng)我們已經(jīng)獲得目的基因片段，選擇好適當(dāng)?shù)目寺。ɑ虮磉_(dá)，轉(zhuǎn)化）質(zhì)粒載體， 并確定重組方案后，下面要進(jìn)行的就是片段之間的體外連接，從而獲得重組子。 此重組子可轉(zhuǎn)入相應(yīng)的宿主菌中用于對目的基因的擴(kuò)增以及目的基因表達(dá)（如現(xiàn)代基因工程藥物的生產(chǎn)），還可用于序列分析和轉(zhuǎn)基因等重要生物技術(shù)的研究中。,1、分子的體外連接,分子的體外連接就是在一定條件下， 由連接酶催化兩個(gè)雙鏈片段組鄰的端磷酸與端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學(xué)過程， 分子的連接是在酶切反應(yīng)獲得同種酶互補(bǔ)序列基礎(chǔ)上進(jìn)行的。,連接反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問題：

2、,1.連接酶 常用的連接酶有兩種： (1)來自大腸桿菌的連接酶 (2)來自噬菌體的連接酶。 二者的作用機(jī)理類似。,連接酶作用機(jī)制,連接酶作用分三步： 連接酶與輔助因子形成酶復(fù)合物。 酶復(fù)合物結(jié)合到具有磷酸基和羥基切口的上，使腺苷化。 產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.,2.連接反應(yīng)的溫度,連接酶的最適反應(yīng)溫度為， 但在此溫度下， 粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折衷方法是過夜。,3. DNA的平未端和粘性末端,由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應(yīng)中就有平未端連接和粘性末端連接。 二者連接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有差異的，,4.堿性磷酸酶處

3、理質(zhì)粒載體,為了提高連接效率，一般采取提高的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現(xiàn)自生連接問題， 為此通常選擇對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其末端的磷酸基，防止環(huán)化， 通過接反應(yīng)后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細(xì)胞后得以修復(fù)。見下圖。,5.連接反應(yīng)的檢測,連接反應(yīng)成功與否，最后的檢測要通過下一步實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化宿主菌， 陽性克隆的篩選來確定。 我們下面的實(shí)驗(yàn)從粘性末端為例操作。,二、實(shí)驗(yàn)試劑 純化后的酶切質(zhì)粒載體和目的基因。 連接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫芐糖醇 500l/ml BSA 連接酶 5mM ATP,三實(shí)驗(yàn)方法,分子的體外連接 在無菌

4、Eppendorf管中加入以下溶液： a. 0.1g質(zhì)粒載體，倍分子的外源。 b. 加無菌水至7.5l，于加溫分鐘使重新退火的粘端解鏈， 將混合物冷卻到。 c. 加入： 連接酶buffer 1l 連接酶 0.1Weiss 5mM ATP 1l 蓋上管蓋，充分混勻，臺式離心扣上離心秒。 下過夜連接反應(yīng)。 反應(yīng)結(jié)束后于保存。,四結(jié)果與分析,電泳檢查連接結(jié)果 如何判斷連接效果的成功性？,問題與討論：,簡述連接酶作用機(jī)理。 簡述一個(gè)完整外源的克隆過程。 連接反應(yīng)中應(yīng)注意些什么問題及如何提高連接效率。,2的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選,一實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?體外通過基因工程手段所構(gòu)建的含目的基因的重組質(zhì)粒，選用轉(zhuǎn)化和

5、篩選技術(shù)， 可獲得含重組的陽性克隆。在此陽性克隆中，可在生物體系中大量擴(kuò)增，繁殖， 保存以及表達(dá)目的基因的產(chǎn)物，這是體外擴(kuò)增所不能替代的。配合重組技術(shù)，所獲得的，不同目的需要的陽性菌株已廣泛應(yīng)用于科研，醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領(lǐng)域。,本實(shí)驗(yàn)由二個(gè)方面組成:,1. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率的高低與實(shí)驗(yàn)的成敗直接相關(guān)， 通常轉(zhuǎn)化效率可達(dá)轉(zhuǎn)化子/g DNA。 獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)體菌的制備。,所謂感受態(tài)， 就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。 關(guān)于感受態(tài)的本質(zhì)與存在，說法很多， 目前主要有兩種假說： 局部原生質(zhì)體化假說感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種能接受的酶位點(diǎn)， 使

6、分子能進(jìn)入細(xì)胞。,制備感受態(tài)細(xì)胞,現(xiàn)在制備感受態(tài)細(xì)胞通常用CaCl2處理，在低溫中與外來分子相混合. 分子轉(zhuǎn)化分以下幾步: 吸附雙鏈分子吸附于受體菌表面； 轉(zhuǎn)入雙鏈分子解鏈。一條鏈進(jìn)入受體菌，另一條降解； 自穩(wěn)外源質(zhì)粒分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈； 表達(dá)一供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，分裂， 轉(zhuǎn)錄翻譯。,2.重組子的篩選,這和受體菌：質(zhì)粒的選擇相關(guān)， 原則上要注意： 受體菌必須是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株； 根據(jù)質(zhì)粒基因型和受體菌基因型互補(bǔ)原則而定。 重組子的篩選方法常用的有兩種方法：,抗生素篩選法,菌株為某種抗生缺陷型， 而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素， 卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生

7、素的培養(yǎng)基上長出。 本實(shí)驗(yàn)利用抗生篩選轉(zhuǎn)化子。,互補(bǔ)法,現(xiàn)在使用的許多載體（如系列）有含有一個(gè)大腸桿菌的短區(qū)段，其中含有半乳糖苷酸基因（lacZ）的調(diào)控序列和頭個(gè)氨基酸偏碼區(qū)。這個(gè)偏碼區(qū)中插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)。 受體菌則含編碼半乳糖苷酶端的序列。當(dāng)外源基因插入時(shí)，二者溶為一體后，有半乳糖苷酶表達(dá)， 在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷（x-gal）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。 而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點(diǎn)，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達(dá)而形成白色菌斑。 通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。,二、實(shí)驗(yàn)試劑,培養(yǎng)基 質(zhì)粒（含Amp抗生基因），受體菌 CaCl2 0.1M Amp,三實(shí)驗(yàn)方法,一、感受態(tài)細(xì)胞制備 將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，培養(yǎng)小時(shí)。 挑取單菌落轉(zhuǎn)入 培養(yǎng)基錐瓶中，振蕩過夜。 從中取菌液轉(zhuǎn)入 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)小時(shí)， 測達(dá)。 培養(yǎng)物于冰上分鐘。 轉(zhuǎn)入離心管，于下離心分鐘。 棄上清，倒置離心管分鐘，流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預(yù)冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上分鐘。 4,000rpm 4離心分鐘，棄上清。 加入2ml，0.1M CaCl2懸浮細(xì)胞，于過夜。,二、轉(zhuǎn)化,在1.5ml Eppendorf管中加入l感受態(tài)細(xì)胞和l 40ng DNA溶液， 溫和混勻，于冰上分鐘。 于水浴秒。 冰浴分鐘。 加入l