1、,第四章 基因誘變與蛋白質(zhì)工程,概 述,自 我 介 紹,曲 萌 北華大學(xué)分子生物學(xué)教研室（419） 醫(yī)學(xué)博士在讀 電話：6605155 郵箱：,基因組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué) 基因工程蛋白質(zhì)工程 問題：1.基因組與蛋白質(zhì)組有什么聯(lián)系？ 2.蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別 ？,DNA,mRNA,復(fù) 制,轉(zhuǎn)錄,蛋白質(zhì),表 達(dá),胞漿,核,遺 傳 信 息 流 程 圖,基因組與蛋白質(zhì)組有什么聯(lián)系？,遺傳信息從DNA到mRNA，然后合成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和功能蛋白質(zhì)，構(gòu)成有機體，完成生命的功能。 基因是遺傳信息的源頭，而蛋白質(zhì)是基因功能的體現(xiàn)者和執(zhí)行者。 HGP完成了基因序列的確定，但它不能提供認(rèn)識各種生命活動的直接分子基礎(chǔ)

2、，所以必須研究生命活動的執(zhí)行者蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究宗旨就是解決這個問題。 蛋白質(zhì)組的研究是對基因組研究的重要補充，也是后基因組時代研究基因功能的最重要途徑。,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的特點,研究對象的整體性 研究目標(biāo)的動態(tài)性 體現(xiàn)生命的復(fù)雜性,研究對象的整體性,當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)的主要任務(wù)是： 傳統(tǒng)上，我們只是對某一發(fā)育階段或特定位置上的單個基因進(jìn)行研究，缺乏對蛋白質(zhì)全面、整體的認(rèn)識，而蛋白質(zhì)組學(xué)是把基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)作為研究對象，在建立和發(fā)展蛋白質(zhì)組研究技術(shù)方法的同時，進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。 分析工作主要有兩個方面： 一方面建立正常生理條件下機體、組織、細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的圖譜和數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白質(zhì)組群

3、的整體信息，為進(jìn)一步的分析工作提供基礎(chǔ)； 另一方面比較分析非生理條件下蛋白質(zhì)組所發(fā)生的變化。,研究目標(biāo)的動態(tài)性,組成有機體的所有不同細(xì)胞都共享一個基因組，即一個有機體只有一個確定的基因組。 但基因組內(nèi)各個基因的表達(dá)條件、程度都要隨時間、地點、環(huán)境的不同而不同。所以，蛋白質(zhì)組是一個動態(tài)的概念。,體現(xiàn)生命的復(fù)雜性,HGP表明：30億對堿基，僅編碼2.6-3.9萬個不同的基因。人類的復(fù)雜性體現(xiàn)在表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)雜性，即蛋白質(zhì)的復(fù)雜性。 證 明 一個基因并不只存在一個相應(yīng)的蛋白質(zhì)，可能有幾個或幾十個。 基因也不能直接決定一個功能蛋白。 很多疾病并不完全是因為基因改變所造成，基因的表達(dá)方式錯綜復(fù)雜。 同一個

4、基因在不同的條件下，可能會起到完全不同的作用。 基因不能完全決定蛋白質(zhì)后期加工、修飾及轉(zhuǎn)運定位的全過程。,基因工程的基本步驟,玫瑰的栽培歷史可以追溯到5000年前，但通過色素呈現(xiàn)出藍(lán)色的玫瑰卻從來沒有過。從藍(lán)色三葉草中提取制造藍(lán)色色素的基因，然后注入到玫瑰中，并成功地讓翠雀花素單獨顯色。,畜產(chǎn)系 鄭登貴 教授,抗蟲基因轉(zhuǎn)殖煙草,熒光基因轉(zhuǎn)殖魚,抗老化轉(zhuǎn)殖蘭花,基因轉(zhuǎn)殖羊,目的基因,基因載體,重組體,分,切,接,轉(zhuǎn),篩,表,總體技術(shù)路線,目的基因的分離與合成,需要克隆的DNA片段：,化學(xué)合成法,cDNA文庫 基因組DNA文庫,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),分:,一、質(zhì)粒載體(plasmid ),質(zhì) 粒,Pla

5、smid ： 獨立于細(xì)菌 染色體外能 自主復(fù)制的 小型雙鏈環(huán) 狀DNA分子。,噬菌體(phage),噬菌體載體 粘粒 單鏈絲狀噬菌體,真核細(xì)胞的克隆載體,SV40(猴腎病毒)載體 穿梭載體 反轉(zhuǎn)錄病毒載體,人工染色體,酵母人工染色體 （yeast artificial chromosome,YAC） 細(xì)菌人工染色體（BAC） 噬菌體人P1衍生的人工染色體（PAC） 哺乳動物人工染色體（MAC）,限制性內(nèi)切酶酶切,酶切,切:,目的基因,基因載體,重組體(復(fù)制子),基因重組,接:,連 接 方 法,1.粘性末端的連接 (cohesive end ligation) 2.同聚體加尾部連接 (homop

6、loymeric tails ligation) 3.人工接頭法 (artificial linker ligation),轉(zhuǎn)化： 1)CaCl2處理后的轉(zhuǎn)化 2）電擊法 轉(zhuǎn)染： 1)CaCl2處理后的轉(zhuǎn)染 2）電擊法 3) 其他方法：（1）聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法 （2）磷酸鈣-DNA共沉淀法 （3）二乙胺乙基-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 （4）原生質(zhì)體融合 （5）脂質(zhì)體法 （6）細(xì)胞核的顯微注射法,轉(zhuǎn) :,一、根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)行篩選 1.抗藥性標(biāo)志篩選 2.抗藥性標(biāo)志插入失活 3.根據(jù)外源DNA片段性狀篩選 4. -半乳糖苷酶系統(tǒng) 二、根據(jù)重組DNA的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選 1.重組DNA的快速裂解與鑒定

7、 2.限制性內(nèi)切酶圖譜分析法 3.核酸分子雜交方法進(jìn)行鑒定 4.PCR擴增方法進(jìn)行鑒定,篩 :,一、原核表達(dá)體系,二、真核表達(dá)體系 1.酵母表達(dá)體系 2.昆蟲表達(dá)體系 3.哺乳類動物細(xì)胞,表:,概 論,1.蛋白質(zhì)工程:崛起的緣由、概念 2.常用技術(shù)：定點誘變（ 概念、意義） 3.蛋白質(zhì)改造范圍 4.改造類型,基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存 在的蛋白質(zhì)，這些天然蛋白質(zhì)是生物在 長期進(jìn)化過程中形成的，它們的結(jié)構(gòu)和 功能符合特定物種生存的需要，卻不一 定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。,蛋白質(zhì)工程崛起的緣由,由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定順序連接而成的，每一種蛋白質(zhì)有自己獨特的氨基酸順序，所以改變

8、其中關(guān)鍵的氨基酸就能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。而氨基酸是由三聯(lián)體密碼決定的，只要改變構(gòu)成遺傳密碼的一個或兩個堿基就能達(dá)到改造蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)工程的一個重要途徑就是根據(jù)人們的需要，對負(fù)責(zé)編碼某種蛋白質(zhì)的基因重新進(jìn)行設(shè)計，使合成的蛋白質(zhì)變得更符合人類的需要。這種通過造成一個或幾個堿基定點突變，以達(dá)到修飾蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)目的的技術(shù)，稱為基因定點突變技術(shù)。,蛋白質(zhì)工程概念,通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動力學(xué)的研究獲取關(guān)于蛋白質(zhì)物理、化學(xué)等各方面的信息，在此基礎(chǔ)上對編碼該蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行有目的設(shè)計、改造，并通過基因工程等手段將其進(jìn)行表達(dá)和分離純化，最終將其投入實際應(yīng)用。,一般認(rèn)為蛋白質(zhì)工程就是通過基因重組技

9、術(shù)改變或設(shè)計合成具有特定生物功能的蛋白質(zhì)。實際上蛋白質(zhì)工程包括蛋白質(zhì)的分離純化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的分析、設(shè)計和預(yù)測，通過基因重組或其它手段改造或創(chuàng)造蛋白質(zhì)。從廣義上來說，蛋白質(zhì)工程是通過物理、化學(xué)、生物和基因重組等技術(shù)改造蛋白質(zhì)或設(shè)計合成具有特定功能的新蛋白質(zhì)。,蛋白質(zhì)工程是在基因重組技術(shù)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)之上，融合了蛋白質(zhì)晶體學(xué)、蛋白質(zhì)動力學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和計算機輔助設(shè)計等多學(xué)科而發(fā)展起來的新興研究領(lǐng)域。 其內(nèi)容主要為：根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)之上，實現(xiàn)從氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)

10、構(gòu)和生物功能，設(shè)計合成具有特定生物功能的全新的蛋白質(zhì)，這也是蛋白質(zhì)工程最根本的目標(biāo)之一。,蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 顧孝誠,簡單地講，蛋白質(zhì)工程就是根據(jù)蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)和生物活力的作用機制之間的關(guān)系，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至于創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程在誕生之日起就與基因工程密不可分?；蚬こ淌峭ㄟ^基因操作把外源基因轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)纳矬w內(nèi)，并在其中進(jìn)行表達(dá)，它的產(chǎn)品還是該基因編碼的天然存在的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程則更進(jìn)一步根據(jù)分子設(shè)計的方案，通過對天然蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造，來實現(xiàn)對其所編碼的蛋白質(zhì)

11、的改造，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質(zhì)，而是經(jīng)過改造的，具有了人類所需要的優(yōu)點的蛋白質(zhì)。天然蛋白質(zhì)都是通過漫長的進(jìn)化過程自然選擇而來的，而蛋白質(zhì)工程對天然蛋白質(zhì)的改造，好比是在實驗室里加快了的進(jìn)化過程，期望能更快、更有效地為人類的需要服務(wù)。 摘自科技日報,蛋白質(zhì)工程的一個重要途徑就是根據(jù)人們的需要，對負(fù)責(zé)編碼某種蛋白質(zhì)的基因重新進(jìn)行設(shè)計，使合成的蛋白質(zhì)變得更符合人類的需要。這種通過造成一個或幾個堿基定點突變，以達(dá)到修飾蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)目的的技術(shù)，稱為基因定點突變技術(shù)。,定點誘變,概念：專一的改變基因中某個或某些特定氨基酸的技術(shù)。 意義：可以產(chǎn)生具有工業(yè)上和醫(yī)學(xué)上所需性狀 的蛋白質(zhì)。 為什么定點誘變

12、是蛋白質(zhì)工程的常用技術(shù)？,為什么定點誘變是蛋白質(zhì)工程的常用技術(shù)？,雖然常規(guī)的突變、選擇的方法也可用于設(shè)計所需的蛋白質(zhì)，但用常規(guī)突變方法無法預(yù)先確知哪個核苷酸發(fā)生了變化，因而可能產(chǎn)生的突變蛋白數(shù)目很多，由于絕大多數(shù)氨基酸的替換會降低酶的活性，因此常規(guī)的突變方法一般很少使目的蛋白向好的方面改變。,思考：基因定點誘變技術(shù)與基因突變的比較,DNA復(fù)制過程中,產(chǎn)生新基因，從而產(chǎn)生新性狀,生物體外,生物體內(nèi),定向改造,不定向性,PCR技術(shù),物理化學(xué)方法,改造范圍,1.改變酶促反應(yīng)的Km與Vam,可改變反應(yīng)的催比效率 2.改變蛋白質(zhì)的PH或溫度穩(wěn)定范圍，可改變蛋白質(zhì)的作用條件 3.改變酶在非水溶劑中的反應(yīng)性

13、，以便在非生理條件下產(chǎn)生作用 4.改變某種酶，使其不再需要加入輔助因子，簡化持續(xù)生產(chǎn)過程 5.提高酶對底物的親和力，以增強酶的專一性，減少副反應(yīng) 6.增強蛋白質(zhì)對胞內(nèi)蛋白酶的抗性，可簡化純化過程，提高產(chǎn)率 7.改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)部位，減少反饋抑制，使產(chǎn)物的產(chǎn)率提高 8提高蛋白質(zhì)的抗氧化能力 9.根據(jù)需要改變酶的底物專一性 10. 改變蛋白質(zhì)發(fā)生作用的種屬特異性,改造類型,蛋白質(zhì)水平上 基因水平 那個類型的改造更簡便?為什么？,蛋白質(zhì)水平上,翻譯后的加工 高級結(jié)構(gòu)的修飾： 亞基聚合 輔基連接：磷酸化、糖基化 一級結(jié)構(gòu)的修飾 蛋白質(zhì)合成后的靶向運送,肽鏈從核蛋白體釋放后，不一定具備生物活性， 需經(jīng)過

14、細(xì)胞內(nèi)各種修飾處理過程，成為有活性的 成熟蛋白質(zhì)。,亞基聚合,具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)由兩條以上的肽鏈 通過非共價聚合，形成寡聚體。 血紅蛋白分子22的聚合，各亞基雖具有獨立功能，但又必須相互依存，才能得以發(fā)揮作用。,視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，Rb）,兒童期就發(fā)病的眼科惡性腫瘤，貓眼。 遺傳型多為雙側(cè)發(fā)病，發(fā)病早，有家族史。 非遺傳型多為單側(cè)發(fā)病，且在2歲以后才發(fā)病。,Rb基因表達(dá)產(chǎn)物為 p105-Rb 有2種形式： 磷酸化型（腫瘤細(xì)胞中存在） 非磷酸化型 （是活化型，抑制細(xì)胞增殖）,p53基因“基因衛(wèi)士” 人類p53基因位于17p13，全長16-20kb，含11個外顯子，轉(zhuǎn)錄

15、2.8kb的mRNA，編碼蛋白質(zhì)為p53。 p53蛋白分布于細(xì)胞核中，以四聚體形式與DNA結(jié)合，磷酸化的p53蛋白是活性形式。 p53蛋白屬于核轉(zhuǎn)錄因子。 野生型p53是一種抑癌基因，而突變的p53有癌基因作用。 p53基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。,糖蛋白的糖基化是目前基因工程中一個未解決的關(guān)鍵問題。不少生物活性物質(zhì)，當(dāng)用基因工程方法表達(dá)出其肽鏈后，還不具備活性。因此如何使該蛋白質(zhì)實現(xiàn)糖基化是正在大力研究中的問題之一。,基因水平,對編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造 小改 中改 大改,小改,改變一個或幾個核苷酸。 通過基因突變技術(shù)，可有目的的改造蛋白質(zhì)分子中的一/幾個氨基酸殘基(ami

16、noacidresidual)，借以研究和改善蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能。 改造有兩種方法： 一、在蛋白質(zhì)分子中導(dǎo)入二硫鍵 二、改變蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列,即在蛋白質(zhì)中替換一個肽段或者一個特定的結(jié)構(gòu)域。 蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)可以看作是由結(jié)構(gòu)元件組裝而成的，可以在不同的蛋白質(zhì)之間成段地替換結(jié)構(gòu)元件，期望能夠使相應(yīng)的功能也有所轉(zhuǎn)移。 這一方面經(jīng)常利用的是缺失誘變技術(shù)和結(jié)構(gòu)域互換技術(shù)。,中改,即所謂從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子。從頭設(shè)計是從氨基酸殘基出發(fā)，即從一級序列出發(fā)，設(shè)計制造自然界中 不存在的全新蛋白質(zhì)，使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和預(yù)期功能。 必須指出的是現(xiàn)在對蛋白質(zhì)分子的從頭設(shè)計的例子尚不多，只限于幾個較小的多肽，其結(jié)構(gòu)完全由螺旋或折疊組成，只有當(dāng)人們完全掌握了一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)的規(guī)律，明白了高級結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系，才能真正從頭設(shè)計蛋白質(zhì)分子。 但用蛋白質(zhì)工程對限制性內(nèi)切核酸