1、,第三節(jié) 熱原檢查法,熱原（pyrogen）系指能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。 它包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。 這里所指的“熱原”，主要是指細(xì)菌性熱原，是某些細(xì)菌的尸體及其代謝產(chǎn)物。大多數(shù)微生物都能產(chǎn)生熱原，致熱能力最強(qiáng)的是革蘭氏陰性桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭陽性桿菌類，革蘭陽性球菌則較弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)是脂多糖和微量蛋白的復(fù)合物,熱原的定義,熱原與細(xì)菌內(nèi)毒素的區(qū)別,熱原物質(zhì)包括了細(xì)菌內(nèi)毒素，細(xì)菌內(nèi)毒素是眾多熱原物質(zhì)中的一種，也是最主要的一種。 一般來說內(nèi)毒素是熱原,但熱原不僅僅包括內(nèi)毒素。不是每一種熱原都具有脂多糖的結(jié)

2、構(gòu)，但所有已知的細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖都有熱原活性。在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）條件下，藥品生產(chǎn)的質(zhì)量控制一般可以接受的觀點(diǎn)是：不存在細(xì)菌內(nèi)毒素意味著不存在熱原。,熱原除具有很強(qiáng)的致熱性外，還具有下列性質(zhì)： 耐熱性：1802小時以上或25030min以上才能徹底破壞熱原。因此，玻璃制品如生產(chǎn)過程中所用的容器和注射時使用的注射器等，均可用高溫破壞熱原。 水溶性：熱原能溶于水，可用大量無熱原注射用水沖洗以除去熱原。 不揮發(fā)性：熱原本身不揮發(fā)，但可隨水蒸汽霧滴帶入蒸餾水中，故用蒸餾法制備注射用水時，蒸餾水器應(yīng)有隔離裝置。 濾過性：熱原體積極小,直徑150nm,可通過普通濾器進(jìn)入濾液中。 不耐強(qiáng)酸、強(qiáng)堿

3、、強(qiáng)氧化劑：熱原能被鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等所破壞。,熱源的性質(zhì),熱原反應(yīng)：熱原進(jìn)入機(jī)體后的數(shù)分鐘至1小時內(nèi),突然發(fā)冷、寒戰(zhàn)、面色蒼白、四肢冰冷、煩躁不安等癥狀。持續(xù)時間約0.51小時。寒戰(zhàn)消失后,隨即高熱,但也有無寒戰(zhàn)期而突然高熱者。病人體溫迅速上升,在24小時體溫上升至高峰,一般在3940,嚴(yán)重者高達(dá)41以上,病人面色潮紅、頭痛、惡心、嘔吐。嚴(yán)重者瞻妄、昏迷,甚至死亡。,熱原的危害,熱原檢查法的定義,本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定,試驗(yàn)用的注射器、針頭及 一切和供試品溶液接觸的耐高

4、 溫器皿,應(yīng)置烘箱中用250加 熱30分鐘（英國藥典2001h） 不耐高溫器皿可置于30 雙氧水中浸泡4h，再用細(xì)菌內(nèi) 毒素檢查用水充分沖洗，60 烘干備用,實(shí)驗(yàn)耗材去熱原,實(shí)驗(yàn)動物的選擇,抓取兔子的正確方法：一手抓持兔頸背部皮毛，一手托起兔臀部。 在熱原檢查前12日，供試用家兔應(yīng)盡可能處于同一溫度的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)室和飼養(yǎng)室的溫度相差不得大于3，在試驗(yàn)全部過程中，應(yīng)注意室溫變化不得大于3。 應(yīng)避免噪音干擾。 整個試驗(yàn)操作過程應(yīng)盡量輕柔，避免激惹動物，造成體溫大幅波動，影響結(jié)果。 家兔在試驗(yàn)前至少1小時停止給食并置于適宜的裝置中,直至試驗(yàn)完畢。 讀取體溫：一手拿住體溫計(jì)尾部，使眼與體溫計(jì)保持同一水

5、平，然后慢慢地轉(zhuǎn)動體溫計(jì) ，從正面看到水銀柱時就可讀出相應(yīng)的溫度值 ，切記不可用手碰觸水銀球端 靜脈給藥前需將供試品溫?zé)嶂?8（美國藥典372，英國藥典38.5），注射要緩慢。,注意事項(xiàng),1.試驗(yàn)前至少1小時停止給食并置于適宜的裝置中，使其適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境，飼養(yǎng)溫度與環(huán)境溫度相差3。 2.每隔30分鐘測量體溫1次，一般測量2次（英國藥典測4次，但前2次舍去），兩次體溫之差不得超過0.2,以此兩次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。當(dāng)日使用的家兔，正常體溫應(yīng)在38.039.6的范圍內(nèi)，且各兔間正常體溫之差不得超過1。兩次體溫的平均值作為兔的正常體溫。 2、測定其正常體溫后15分鐘以內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)

6、定劑量（10ml/kg）并溫?zé)嶂良s38的供試品溶液. 3.每隔30min按前法測量其體溫1次,共測6次。 4.以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高度數(shù)，當(dāng)動物升溫為負(fù)值時，以0計(jì)算。,初 試,初試結(jié)果判斷:,復(fù)試及結(jié)果判斷:,傳統(tǒng)熱原檢測方法的不足,內(nèi)毒素法：,家兔法：,費(fèi)用高 結(jié)果重復(fù)性差 使用活體動物實(shí)驗(yàn),只能檢測細(xì)菌內(nèi)毒素 鱟（hu）資源日益匱乏,鱟（hu）亦稱馬蹄蟹。肢口綱（Merostomata）劍尾目（Xiphosura）海生節(jié)肢動物，共4種，見于亞洲和北美東海岸。雖又稱馬蹄蟹，但不是蟹，而與蝎、蜘蛛以及已絕滅的三葉蟲有親緣關(guān)系。 鱟(horseshoe crab

7、)是一類與三葉蟲 （現(xiàn)在只有化石）一樣古老的動物。鱟的祖先出現(xiàn)在地質(zhì)歷史時期古生代的泥盆紀(jì)，當(dāng)時恐龍尚未崛起，原始魚類剛剛問世，隨著時間的推移，與它同時代的動物或者進(jìn)化、或者滅絕，而惟獨(dú)只有鱟從4 億多年前問世至今仍保留其原始而古老的相貌,所以鱟有“活化石”之稱。,藍(lán)血的活化石-鱟,鱟具有很高的藥用價值,，它的血液中含有銅離子，它的血液是藍(lán)色的。這種藍(lán)色血液的提取物“鱟試劑”，可以準(zhǔn)確、快速地檢測人體內(nèi)部組織是否因細(xì)菌感染而致病；在制藥和食品工業(yè)中，可用它對毒素污染進(jìn)行監(jiān)測?？茖W(xué)家也使用鱟血研究癌癥。但是，對鱟抽血后，它們就被放生,隨著各種新技術(shù)產(chǎn)品的出現(xiàn)及現(xiàn)有方法存在的問題，傳統(tǒng)熱原檢測方法

8、日趨落后，不適應(yīng)于產(chǎn)品的熱原檢測。,外熱原 人體（分泌內(nèi)熱原） 體溫調(diào)節(jié)中樞 發(fā)熱,新方法主要以應(yīng)用動物來源或人源細(xì)胞模擬人體，通過檢測內(nèi)源性熱原（主要為細(xì)胞因子，如IL-6、IL-1、TNF-）在體外進(jìn)行熱原檢測。,新方法原理,細(xì)胞（分泌內(nèi)熱原）,國外對新方法的研究始于20世紀(jì)80年代，國際發(fā)達(dá)國家實(shí)驗(yàn)室，包括英國國家生物制品檢定所NIBSC、德國國家疫苗及血清研究所PEI等，均對新的體外熱原檢測替代方法開展了研究。,新方法國外研究現(xiàn)狀,2010版歐洲藥典已收錄了5種新體外熱原檢測方法： 人新鮮全血IL-1法 人新鮮全血IL-6法 人凍存全血IL-1法 MM6細(xì)胞IL-6法 PBMC細(xì)胞IL-6法, 不使用動物進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 能真實(shí)地模擬人體對熱原的反應(yīng) 能檢測非內(nèi)毒素?zé)嵩?能定量或半定量 能被廣泛地應(yīng)用 操作簡單可行,新方法優(yōu)點(diǎn),新方法國內(nèi)研究現(xiàn)狀,國內(nèi)對新方法的研究與國際相比有一定差距，