1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE,一、什么是SDS？,十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一種陰離子去污劑。它在水溶液中以單體 （monomer）和分子團(tuán)（micellae）的混合形 式存在。,SDS的作用,破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變原有的構(gòu)象，保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。,一、SDS-PAGE的基本原理,（一）蛋白質(zhì)分子的解聚 樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞

2、基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。,1、SDS 陰離子去污劑 變性劑 助溶性試劑 斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵 分子去折疊 破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu),2、強(qiáng)還原劑 巰基乙醇（-mercaptoethanal） 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。,SDS和還原劑的作用：（1）分子被解聚或組成它們的多肽鍵（2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù) 電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。（3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超 過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除 了不同分子之間原有的電荷差異。,蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點（1）形狀像一

3、個長橢圓棒（2）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的。（3）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比。,膠束在SDS-PAGE系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD200KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系,3、影響SDS電泳的關(guān)鍵因素（1） 溶液中SDS單體濃度 大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1：1.4（2） 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度 低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。,（3） 二硫鍵是否完全被還原 當(dāng)二硫鍵被徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合

4、到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關(guān)系。,（二）緩沖系統(tǒng)的選擇 一般情況下，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。,電泳緩沖液的種類：1、磷酸緩沖液2、Tris-醋酸鈉緩沖系統(tǒng)3、咪唑緩沖液系統(tǒng)： 比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電性低，電泳速 度要比后者快一倍。4、尿素系統(tǒng)： 適用分子量低于15KD的蛋白樣品。5、Tris-甘氨酸系統(tǒng)： 使用最多的緩沖液6、Tris-硼酸鹽緩沖液： 測定糖蛋白的分子量,（三）凝膠濃度的選擇 由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)膠束的

5、大小，因此凝膠濃度的選擇會直接影響分辨率。 不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度.,（四）分子量測定1、相對遷移率（Rf） Rf即用每個帶的遷移距離除以溴酚藍(lán)前沿的遷移距離得到的。 測量位置應(yīng)在蛋白帶的中央。 蛋白帶遷移距離Rf= 溴酚藍(lán)遷移距離,蛋白帶遷移距離 固定前的凝膠長度 Rf= X 干燥后的凝膠長度 溴酚藍(lán)遷移距離,2、作圖 以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對數(shù)值為縱坐標(biāo)，Rf為橫坐標(biāo)繪圖,3、通過測定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標(biāo) 準(zhǔn)曲線上讀出他的分子量,二、去污劑的選擇無離子去污劑：Lubro W；Brij35， Tween Triton陽離子去污劑：cetyltrimethyl a

6、mmonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC）陰離子去污劑：SDS deoxycholate,三、方法1、分類（1）根據(jù)對樣品的處理方式的不同 還原SDS電泳 非還原SDS電泳 帶有烷基化作用的還原SDS電泳,（2）根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同 連續(xù)電泳 不連續(xù)電泳（3）根據(jù)電泳的形式 圓盤電泳 垂直電泳 平板電泳 水平電泳,2、操作（1） 制備分離膠（2） 制備積層膠(堆積膠）,分離膠聚合之后,（3） 加樣品樣品的處理 在蛋白溶液中加入過量的SDS后，可引起以下的反應(yīng)： 蛋白質(zhì)本身的電荷被屏蔽 氫鍵斷裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折疊(二級結(jié)構(gòu)破

7、壞),并形成橢球形,還原SDS處理 當(dāng)加入還原試劑DTT或-二巰基乙醇后，蛋白質(zhì)被完全去折疊，只根據(jù)分子量分離。,帶有烷基化作用的還原SDS處理 烷基化作用可以很好地并經(jīng)久牢固地保護(hù)SH基團(tuán)，而得到窄的電泳帶。,非還原的SDS處理 許多樣品，如生理體液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100煮沸3分鐘，并不需要加還原劑，此時二硫鍵不能被斷裂，蛋白并沒有完全被去折疊。,（4） 電泳 （5） 固定,（6） 染色考馬斯亮藍(lán)（coomassie brilliant blue）R-250 三苯基甲烷，紅藍(lán)色，每個分子含有兩個SO3H基團(tuán)，偏酸性，和氨基黑一樣也是結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上。,G-250 二甲花青亮藍(lán)，藍(lán)綠色。,銀染色 銀染的機(jī)制是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。,（7） 照相，凝膠干燥 （8） 定量測定,3、電泳過程中的不正?，F(xiàn)象（1）“微笑”現(xiàn)象 指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。,（2）“皺眉”現(xiàn)象 由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成