1、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),Immunological experiment technique,一、免疫細(xì)胞分離與功能測(cè)定技術(shù) 1.免疫細(xì)胞分離與純化 2.免疫細(xì)胞功能測(cè)定,二、免疫分子的檢測(cè)技術(shù) 1.細(xì)胞膜分子 2.可溶性分子,1.免疫細(xì)胞分離與純化 (B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC、紅細(xì)胞等) 2.免疫細(xì)胞功能測(cè)定,一、免疫細(xì)胞分離與功能測(cè)定技術(shù),1）單個(gè)核細(xì)胞分離 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法 Percoll不連續(xù)密度梯度離心法,除去,分離,1、免疫細(xì)胞分離與功能測(cè)定,1）單個(gè)核細(xì)胞分離,多次洗滌除去血小板 低滲或氯化銨溶解紅細(xì)胞 黏附除去單核細(xì)胞 L亮酸甲酯除去單核細(xì)胞、

2、NK、Tc 集團(tuán)鐵除去單核細(xì)胞 免疫吸附分離除去單核細(xì)胞 免疫磁珠分離除去單核細(xì)胞,2）淋巴細(xì)胞純化,尼龍棉柱分離,6mm,T細(xì)胞,B 細(xì) 胞,3）B細(xì)胞、T細(xì)胞分離,E花環(huán)分離,3）B細(xì)胞、T細(xì)胞分離,免疫吸附分離,羊抗鼠Ab,3）B細(xì)胞、T細(xì)胞分離,B,B,B,免疫磁珠分離法,免疫磁珠法分離細(xì)胞 細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。,免疫磁珠分離法,免疫磁珠法分為陽(yáng)性分離法和陰性分離法： 陽(yáng)性分離法磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所

3、要分離獲得的細(xì)胞 陰性分離法磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離細(xì)胞為所需細(xì)胞 一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽(yáng)性分離法的大，陽(yáng)性分離法用行更多。,磁珠分離細(xì)胞的重要指標(biāo)是： 純度和得率：取決于磁珠所連接單抗的特異性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠會(huì)影響細(xì)胞活性。目前市場(chǎng)上有2種磁性細(xì)胞分離系統(tǒng)：* Small particles (50 nm) MACS* Large particles (12004500 nm) others（如Dynal）,小磁珠 優(yōu)點(diǎn)：分離后續(xù)培養(yǎng)、 可上流式檢測(cè) 缺點(diǎn)：強(qiáng)的磁場(chǎng)、 速度慢得率低、 成本昂貴大磁珠 優(yōu)點(diǎn)：試管中完成（簡(jiǎn)單）、易于增減細(xì)胞用量、速度快得率高、

4、成本低； 缺點(diǎn)：影響細(xì)胞活性不利于培養(yǎng)、純度低、容易阻塞FCM的噴嘴；,優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn), flow cytometry, T細(xì)胞增生(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn) T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)原理 T細(xì)胞功能的體內(nèi)檢測(cè)法 流式細(xì)胞術(shù) T分泌細(xì)胞因子功能測(cè)定,4）T細(xì)胞功能測(cè)定, T分泌細(xì)胞因子功能測(cè)定, T分泌細(xì)胞因子功能測(cè)定, T分泌細(xì)胞因子功能測(cè)定, T分泌細(xì)胞因子功能測(cè)定, B細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 溶血空斑形成試驗(yàn) 反向溶血空斑試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法,5）B細(xì)胞功能測(cè)定, 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法, 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法, 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法, 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法,1)形態(tài)學(xué)檢查法 2) 51Cr放射性核素釋放法 3)酶釋放法： 4)化學(xué)發(fā)光法 5

5、)流式細(xì)胞術(shù),6）NK細(xì)胞活性測(cè)定,51Cr放射性核素釋放法,6）NK細(xì)胞活性測(cè)定,1)中性粒細(xì)胞趨化功能測(cè)定 2)中性粒細(xì)胞吞噬功能測(cè)定,7）吞噬細(xì)胞功能測(cè)定,3)巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定 4)巨噬細(xì)胞胞毒作用,7）吞噬細(xì)胞功能測(cè)定,8）DC分離與純化,分離DC的原理是依據(jù)樹突狀細(xì)胞的低密度和半粘附特性:具有輕度暫時(shí)性粘附特性-從而可以和其他非粘附細(xì)胞、巨噬細(xì)胞；,8）DC分離與純化,小鼠脾臟DC是1974年首次分離獲得的：利用DC半粘附性將脾臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)3小時(shí)后，洗去非粘附細(xì)胞（淋巴細(xì)胞），純度約為40%-60%； 采用培養(yǎng)板親和粘附提高了DC的純度80-90%，操作方便、花費(fèi)小、但提取

6、的量較少；,8）DC分離與純化,免疫磁珠法分離（CD11c） 分離誘生法:主要是采用直接分離和細(xì)胞因子誘生相結(jié)合的方法,依次去除紅細(xì)胞、T、B細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等而獲得純化樹突狀細(xì)胞及其前體，再聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)下培養(yǎng)； 應(yīng)用細(xì)胞因子誘導(dǎo)人體CD34 細(xì)胞定向分化為樹突狀細(xì)胞近年來(lái)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道；,9）紅細(xì)胞功能測(cè)定,1930年Duke和Wallace發(fā)現(xiàn)錐蟲在抗血清及補(bǔ)體參與下，可黏附到人類紅細(xì)胞膜上，并發(fā)現(xiàn)不同人紅細(xì)胞對(duì)錐蟲的黏附能力不同，推測(cè)在紅細(xì)胞膜上存在者一種與免疫有關(guān)的物質(zhì)。1953年Nelson報(bào)道，型肺炎雙球菌可以被補(bǔ)體調(diào)理結(jié)合到人紅細(xì)胞膜上，此現(xiàn)象稱為免疫黏附，這種

7、黏附需激活補(bǔ)體C3，而不需要激活下游的補(bǔ)體成分，認(rèn)為紅細(xì)胞膜上可能存在免疫黏附受體。,9）紅細(xì)胞功能測(cè)定,直到1963年Nishioka證實(shí)這種免疫黏附現(xiàn)象是通過人紅細(xì)胞膜補(bǔ)體C3受體(現(xiàn)稱CRl或 CD35)而實(shí)現(xiàn)的。1980年Fearon詳細(xì)研究CD35性質(zhì)，表明85%的CD35存在紅細(xì)胞膜上。1981年Siegel在前人研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞可黏附腫瘤細(xì)胞、血清中存在抑制紅細(xì)胞黏附因子、紅細(xì)胞膜上過氧化物酶活性與CD35活性相關(guān)等多種免疫功能，提出了“紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)”的概念， 1982年在開展紅細(xì)胞免疫的研究；,10）干細(xì)胞分離與鑒定,1.細(xì)胞膜分子：黏附分子、受體、配體、胞漿蛋白等細(xì)胞

8、成分； 免疫標(biāo)記技術(shù) 2.可溶性分子：Ig、細(xì)胞因子、可溶性黏附分子、可溶性受體、細(xì)胞分泌的各種分子等等 免疫標(biāo)記技術(shù) 生物學(xué)活性測(cè)定（IL-2等） 分子生物學(xué)測(cè)定（mRNA等）,二、免疫分子的檢測(cè)技術(shù),免疫標(biāo)記技術(shù),免疫標(biāo)記技術(shù),標(biāo)記免疫學(xué)創(chuàng)立于60年代初期，開始以放射免疫分析為代表，以后相繼派生出許多其它的標(biāo)記免疫分析方法。 60年代末期創(chuàng)立了免疫放射分析，其靈敏度、特異性、線性范圍均好。 70年代初建立.酶標(biāo)記免疫分析，價(jià)格低，檢測(cè)方便，無(wú)放射性污染。 70年代中期，發(fā)光信號(hào)進(jìn)行酶免分析建立，靈敏度高，快速。,1.標(biāo)記免疫分析的發(fā)展過程, 90年代中期發(fā)展起全自動(dòng)的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。

9、80年代初期時(shí)間分辨熒光免疫分析問世，已經(jīng)顯示出其良好的發(fā)展前景。用時(shí)間分辨技術(shù)(波長(zhǎng)和時(shí)間兩種分辨)測(cè)量熒光，有效地排除非特異熒光，大大地提高了分析的靈敏度，穩(wěn)定性好，有效期長(zhǎng)，測(cè)量速度快，易于自動(dòng)化，因此被公認(rèn)為有良好發(fā)展前景的非放射性標(biāo)記免疫分析方法之。 重點(diǎn)：提高靈敏度和特異性兩大問題。,1.標(biāo)記免疫分析的發(fā)展過程,2.標(biāo)記免疫分析的分類1,標(biāo)記免疫分析的基本原理： 按照示蹤標(biāo)記物及標(biāo)記技術(shù)分類： 1放射性元素標(biāo)記免疫分析 2酶標(biāo)記免疫分析 3熒光標(biāo)記免疫分析 4金銀標(biāo)記免疫分析 5. 化學(xué)發(fā)光免疫分析,2.標(biāo)記免疫分析的分類1,2.標(biāo)記免疫分析的分類2,按反應(yīng)體系的物理狀態(tài)分類： 1

10、. 均相標(biāo)記免疫分析 2. 非均相標(biāo)記免疫分析 放射性核素分析 酶標(biāo)記免疫分析 熒光標(biāo)記免疫分析 化學(xué)發(fā)光免疫分析 電化學(xué)發(fā)光免疫分析 按照檢測(cè)對(duì)象不同進(jìn)行分類講解：,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),一.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)-常用熒光素,1.常用熒光素 異硫氰酸熒光素(FITC)：呈黃綠色 四乙基羅丹明(RB200)：呈橙紅色，熒光效率較低。 四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)：橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對(duì)比清晰，常用于雙標(biāo)記示蹤。 藻紅蛋白(phycoerythfin，PK)：在流式細(xì)胞術(shù)(FCM)中較常用。 7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin，AMC)：用

11、于雙標(biāo)記或多標(biāo)記。,Cell Ag,一.免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)-常用方法1,1).直接法 熒光素標(biāo)記抗體-抗原,一.免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)-常用方法2,Cell Ag,2).間接法 抗原-已知未標(biāo)記抗體-熒光素標(biāo)記的抗抗體,一.免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)-常用方法3,Cell Ag,補(bǔ)體,3).補(bǔ)體法 直接法 間接法 切片中抗原抗體與補(bǔ)體混合液熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體,4).雙重免疫熒光染色法 可在同一標(biāo)本上定位、定性檢測(cè)兩種抗原。如A抗原的抗體用羅達(dá)明(RB200)標(biāo)記，呈桔紅色，而B抗原的抗體用FITC標(biāo)記呈黃綠色，鏡下兩種不同激發(fā)光，就可以檢測(cè)不同的抗原成分。 常用下列染色法： 一步雙染色法： 二步雙染色

12、法：,一.免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)-常用方法4,一.免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)-常用方法4,二.免疫酶組化技術(shù)-常用酶,酶標(biāo)記法：酶交聯(lián)結(jié)合在抗體上，形成酶標(biāo)記抗體 非標(biāo)記抗體技術(shù)：酶作為抗原與相應(yīng)特異性抗體連接,二.免疫酶組化技術(shù)-常用酶,1.常用酶 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)：底物為H202，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、ABTS為供氫體的反應(yīng)產(chǎn)物可觀察或進(jìn)行比色測(cè)定。 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)： 底物為對(duì)硝基苯磷酸鹽(PNP)、-甘油磷酸鈉、磷酸萘酯等。 葡萄糖氧化酶(gucos

13、e oxidase，GOD)：葡萄糖為底物的酶，供氫體為對(duì)硝基藍(lán)四氮唑(nitroblue tetrazolium，NBT)，酶促反應(yīng)的終產(chǎn)物為不溶性的藍(lán)色沉淀，比較穩(wěn)定。,二.免疫酶組化技術(shù)-常用酶,過氧化物酶-抗過氧化物酶復(fù)合物 (peroxidase-anti peroxidase,PAP) 堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶復(fù)合物 (alkaline phasphatase-antialkaline phasphatase, APAAP),酶標(biāo)記抗體免疫組化常用方法1,1).直接法 酶標(biāo)記抗體與組織細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)抗原反應(yīng),酶標(biāo)記抗體免疫組化常用方法2,人Cell Ag,底物,2).間接法 抗原抗體酶標(biāo)

14、抗抗體復(fù)合物，通過酶底物顯色。,酶標(biāo)記抗體免疫組化常用方法3,人Cell Ag,底物,3).酶標(biāo)抗體三步染色法 由于酶分子的增加，增強(qiáng)了方法的敏感性。,非標(biāo)記抗體免疫酶組化常用方法1,1).酶橋法 靶抗原特異性抗體(如兔抗人)- 二抗即橋抗體(如羊抗兔)抗酶抗體(如兔抗酶)酶液顯色。,人Cell Ag,底物,非標(biāo)記抗體免疫酶組化常用方法2,2).PAP法 靶抗原特異性抗體(如兔抗人)過量橋聯(lián)抗體(如羊抗兔)PAP復(fù)合物(如兔PAP)底物顯色。,人Cell Ag,兔抗人Ab,羊抗兔Ab,3).APAAP法 靶抗原抗體(如兔抗人)二抗即橋聯(lián)抗體(如羊抗兔)復(fù)合物(如兔 APAAP)底物顯色。,人C

15、ell Ag,非標(biāo)記抗體免疫酶組化常用方法3,4).雙PAP法,人Cell Ag,非標(biāo)記抗體免疫酶組化常用方法4,三.親合免疫組織化學(xué)技術(shù)常用方法,1.生物素-親合素技術(shù) 1).親合素生物素過氧化物酶技術(shù)(avidin biotin-pemxidase complex technique，簡(jiǎn)稱ABC技術(shù)) ABC系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。 2).橋聯(lián)親合素生物素技術(shù)(Bridged Avidin-Biotin technique，BRAB技術(shù)) 3).標(biāo)記親合素生物素技術(shù)(Labelled Avidin-Biotin technique，LAB技術(shù)) 2.葡萄球菌A蛋白(SPA) 3.凝集

16、素 1).直接法 2).間接法 3).糖凝集素糖法 4.鏈霉親合素生物素技術(shù)(labelled streptavidin biotinmethod，LSAB):,三.親合免疫組織化學(xué)技術(shù)常用方法,ABC法：人組織標(biāo)本靶抗原第一抗體(如鼠抗人)生物素標(biāo)記的第二抗體(如biotin羊抗鼠)等量的親合素和酶標(biāo)生物素混合液底物顯色。,人Cell Ag,四.免疫金銀及鐵標(biāo)記免疫組化技術(shù),人組織標(biāo)本靶抗原-抗體(如兔抗人)-金標(biāo)二抗(如金標(biāo)羊抗兔)-金顆粒呈紅色（銀顯影液作用后銀顆粒呈棕黑色、膠體鐵通過普魯藍(lán)反應(yīng)呈藍(lán)色）,人Cell Ag,兔抗人Ab,金,羊抗兔Ab,人Cell Ag, ,免疫標(biāo)記測(cè)定技術(shù)

17、,1.熒光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA) 2.均相熒光免疫分析(homogeneous fluorescence immunoassay) 熒光激發(fā)傳遞免疫分析法(fluorescence excitation transfer immunoassay) 已用于嗎啡和IgG等的定量測(cè)定。,一、熒光免疫測(cè)定技術(shù),熒光猝滅免疫測(cè)定法(fluorescence quenching immunoassay) 粒子濃縮熒光免疫分析 (particle concentration fluorescence immunoassay，PCF

18、IA) 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定(time-resolved fluoro-immunoassay，TrFIA) 熒光激活細(xì)胞分類儀：流式細(xì)胞術(shù),一、熒光免疫測(cè)定技術(shù),熒光偏振免疫分析儀,流式細(xì)胞儀,二.放射免疫分析,1.放射免疫測(cè)定(radioimmunoassay，RIA)原理：標(biāo)記抗原和未標(biāo)記待測(cè)抗原對(duì)有限量抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合(或競(jìng)爭(zhēng)性抑制)反應(yīng)。,有限的Ab,二.放射免疫分析,2.放射受體分析(radioreceptor assay，RRA)原理：與免疫放射測(cè)定相似。用于測(cè)定受體的親和常數(shù)、解離常數(shù)、受體結(jié)合數(shù)以及定位分析等。 3.免疫放射測(cè)定(immunoradioimetric assa

19、y IRMA)原理:待測(cè)抗原與過量標(biāo)記抗體的非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，然后加入固相的抗原免疫吸附劑以結(jié)合游離的標(biāo)記抗體，離心除去沉淀，測(cè)定上清液中放射性強(qiáng)度，從而推算出檢晶中抗原含量,三.酶免疫測(cè)定(enzyme immunoassay，EIA),酶免疫測(cè)定分類： 非均相酶免疫測(cè)定(heterogeneous enzyme immunoassay) 均相酶免疫測(cè)定(homogeneous enzyme immunoassay) 常用標(biāo)記酶：HRP、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。,三.酶免疫測(cè)定(enzyme immunoassay，EIA),非均相酶免疫測(cè)定(heterogeneous enzyme im

20、munoassay)是目前應(yīng)用最廣泛，又分為： 固相酶免疫測(cè)定： 瓊脂糖珠(Sepharose 4B)作為載體的DASS體系 聚苯乙烯及其他固相支持物的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 液相酶免疫測(cè)定,1.固相酶免疫測(cè)定常用方法1,(1)間接法：已知抗原吸附固相載體-待檢抗體-洗滌-酶標(biāo)抗抗體-底物顯色-目測(cè)或酶標(biāo)儀測(cè)光密度值定量測(cè)定,1.固相酶免疫測(cè)定常用方法2,(2)雙抗體夾心法：已知抗體吸附固相載體-待檢抗原-洗滌-酶標(biāo)抗體-底物顯色,1.固相酶免疫測(cè)定常用方法3,(3)競(jìng)爭(zhēng)法： 測(cè)定抗原： 測(cè)定抗體：,1.固相酶免疫測(cè)定常用方法4,(4)MAC-ELISA：捕獲法測(cè)IgM的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱MAC

21、-ELISA)，抗人IgM(鏈)抗體包被固相載體-待檢血清IgM-洗滌-特異性抗原-酶標(biāo)抗體-底物顯色,底物,1.固相酶免疫測(cè)定常用方法5,(5)斑點(diǎn)ELISA(dot-ELISA) 吸附蛋白質(zhì)能力強(qiáng)的硝酸纖維素膜(NC膜)為載體，進(jìn)行間接法或夾心法，呈色斑點(diǎn)，常用于篩選單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞；在各種病毒性疾病和寄生蟲病的臨床診斷與血清流行病學(xué)調(diào)查中亦廣泛使用。,雜交瘤細(xì)胞,(6)ABC法,NC膜,1.固相酶免疫測(cè)定常用方法7,(7)免疫印記,能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定其分子量，常用于檢測(cè)多種病毒的抗體或抗原，如抗HIV抗體的檢測(cè)。,2.液相酶免疫測(cè)定,液相酶免疫測(cè)定 在液相中進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，需加分離劑將游離的酶標(biāo)記物分離，然后再加底物顯色測(cè)定。分為平衡法和非