1、,雞病血清學(xué)檢驗(yàn),一 原 理 許多病毒具有凝集動(dòng)物紅細(xì)胞的能力, 這種凝集能力可被相應(yīng)的抗體所抑制, 故可用已知病毒檢測(cè)相應(yīng)的血凝抑制抗體 . 也可以用已知標(biāo)準(zhǔn)抗體對(duì)分離的病毒進(jìn)行鑒定.,紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn),二 使用范圍 新城疫、 禽流感、 減蛋綜合征、 雞毒支原體、 滑液囊支原體等病原微生物感染后的抗體檢測(cè)；或相應(yīng)病原分離后的鑒定,三 器材 1.血凝板、 2.微量移液器 3.標(biāo)準(zhǔn)抗原 4.1%紅細(xì)胞懸浮液 5.被檢血清 6.稀釋液,四 操作程序 （一）0.5紅細(xì)胞的準(zhǔn)備 1.阿氏液(抗凝劑)的配制 葡萄糖1.866 檸檬酸鈉0.8 檸檬酸0.055 氯化鈉 0.418g 蒸餾水 100ml

2、混勻放入100 ml葡萄糖瓶內(nèi)，10磅115度10分鐘 高壓滅菌。冷卻后4保存?zhèn)溆谩?2.采血 取健康雞翅靜脈或心臟采血，(按阿氏液2份，血液1份） 注意:(1). 兩只健康的雞血混合; (2). 阿氏液的量要夠,3. 紅細(xì)胞懸液的配制： 將血液注入離心管中，經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5-10分鐘，用吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，將沉淀的細(xì)胞加稀釋液（生理鹽水）洗滌，再用離心機(jī)3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，充去上清液，再加稀釋液洗滌， 如此反復(fù)洗滌三次，將最后一次離心后的紅細(xì)胞，按1%的稀釋度加入稀釋液（1毫升紅細(xì)胞泥加99毫升稀釋液）。,(二)被檢血清 將被檢雞群編號(hào)登記，用消毒

3、過的干燥注射器采血，注入潔凈干燥試管內(nèi)（微量法可用孔經(jīng)2-3毫米塑料管由翅靜脈采血），在室溫中靜置或離心，待血清析出后使用。 注意: 每只雞應(yīng)更換一個(gè)注射器，嚴(yán)禁交叉使用。,(三） 血凝抗原效價(jià)測(cè)定 （操作量25ul） (1)抗原 一般以雞新城疫II系或Lasota系作為已知抗原。 來源: 1).購買: 目前也有用聚乙二醇使Lasota系病毒液濃縮，作 成穩(wěn)定濃縮抗原，HA效價(jià)達(dá)1：5000以上，4半年 不變。,2) 自制: A. 用雞新城疫II系或者Lasota系疫苗接種雞胚制備抗原： B. 疫苗用滅菌生理鹽水稀釋10倍，以0.1毫升接種于10日齡的雞胚尿囊內(nèi); C. 凡接種后72-120小

4、時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，且病變顯著者，分別收獲雞胚尿囊液于消毒試管內(nèi)，如有血細(xì)胞應(yīng)離心（2000轉(zhuǎn)/分鐘）15分鐘，取上清液; D. 作HA試驗(yàn)，其凝集價(jià)在1：640以上的雞胚雞，分裝于潔凈干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱備用。,2.抗原血凝價(jià)的測(cè)定 每種抗原做兩排，結(jié)果取均值 1). 1-12孔加生理鹽水25ul 2). 第1孔加抗原25ul，反復(fù)吹打10次吸取25ul到第2孔，依此類推倍比稀釋至第11孔 3). 最后從第11孔吸取25ul棄去,第12孔做生理鹽水對(duì)照 4). 所有孔加25ul 1紅細(xì)胞 5). 將血凝板振蕩1分鐘,6 新城疫病毒室溫（1822）作用 30分; 禽流感病毒37作用30分.

5、夏季結(jié)果出現(xiàn)快，冬季較慢 新城疫病毒時(shí)間長，溫度高易發(fā)生洗脫 7 結(jié)果判定 1).完全凝集孔為終點(diǎn) 2).將血凝板成45角豎立觀察 3).紅細(xì)胞呈淚滴狀沉淀為不凝集 4).孔底沒有紅細(xì)胞沉淀,紅細(xì)胞均勻平鋪于孔底為凝集,此孔稀釋倍數(shù)為1個(gè)工作單位,雞新城疫紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA試驗(yàn)） (過程圖),注意 能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒液的最高稀釋倍數(shù)，稱為該病毒液的紅細(xì)胞凝集效價(jià)。如上例，病毒病的HA效價(jià)為1：320。,（四) 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn) 1. 抗原準(zhǔn)備（工作濃度的準(zhǔn)備 ） 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI試驗(yàn)）時(shí)，病毒抗原液25ul內(nèi)需含4個(gè)凝集單位，所以，應(yīng)將原菌抗原毒作成320/4=80倍稀釋。

6、,2 操作步驟 (1) 每孔加25ul的稀釋液: 第1孔加25ul待檢血清，反復(fù)吸吹10次; 吸取25ul于第 2孔，以此類推倍比稀釋至第11孔; 最后從第11孔取2 5ul棄去,第12孔為抗原對(duì)照; (3) 每孔加4單位抗原;室溫下( 18-22)作用30分 (4) 取1紅細(xì)胞25ul加于各孔中 (5) 將血凝板振蕩1分鐘 (6) 室溫作用30-45分鐘（禽流感 37）觀察結(jié)果 (7) 結(jié)果判定 將血凝板呈45豎起觀察 完全抑制孔紅細(xì)胞呈淚滴樣下沉,此孔為抑制終點(diǎn).,雞新城疫紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（H試驗(yàn)） (過程圖),放室溫作用分鐘,單位：l,3.結(jié)果報(bào)告 (1).雞的免疫臨界水平。 (2).

7、雞群的HI抗體水平是以抽檢樣品的HI抗體效價(jià)（log2） 的平均值表示的。 (3).檢樣中HI抗體效價(jià)的最高值與最低值相差太大時(shí)，。 (4).大型養(yǎng)雞場(chǎng)，每次進(jìn)行抽測(cè)時(shí)，抽樣率一般不低于 0.1%-0.5%，小型雞群，抽樣率應(yīng)有所增加，一般認(rèn)為 理想的抽樣率應(yīng)為2%。 (5）.雞群接種新城疫疫苗后，經(jīng)2-3周測(cè)血清中的HI抗體效 價(jià)若提高2個(gè)滴度以上，表示免疫應(yīng)答良好，疫苗接種 成功；若HI抗體效價(jià)無明顯提高，表示免疫失敗。,瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）,一 原理 抗原、抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中,可以向四周擴(kuò)散,當(dāng)抗原抗體擴(kuò)散到適當(dāng)比列處相結(jié)合,出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線. 常用已知抗原檢測(cè)相應(yīng)的

8、抗體,適用范圍 ( 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)適用) 禽流感、 傳染性支氣管炎 傳染性法氏囊病、 傳染性喉氣管炎 雞痘、 馬立克氏病、 傳染性腦脊髓炎 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥、 病毒性關(guān)節(jié)炎 多殺性巴氏桿菌病的抗體檢測(cè)。,三 器材,瓊脂擴(kuò)散板（平皿）;打孔器、 移液器;0.01M PH 7.2 的磷酸緩沖液;瓊脂粉（糖）,四 操作程序 （一）瓊脂板制備 1 瓊脂粉1g 磷酸鹽緩沖液100ml 2 加熱煮沸， 搖動(dòng)燒瓶使瓊脂粉溶解 3 加入8g氯化鈉振蕩燒瓶，使氯化鈉溶解， 4 待瓊脂稍涼不燙手，倒板厚度為2.53mm 5 瓊脂凝固后，將其倒置濕盒內(nèi)，4保存?zhèn)溆?（二） 打孔 1 用打孔器按7孔梅花圖案打孔 孔徑

9、為3mm-4mm,孔距為3mm 大平皿可打六組梅花孔 2 打孔后用7#針頭挑出孔內(nèi)瓊脂 3 最后在酒精燈上燒烤封底,（三） 加樣 1 中間孔加抗原 2 外周孔加血清 1、4 孔加陽性血清; 其他 孔加待檢血清; 加樣至滿孔為止; 3 室溫下放置1020分鐘 使孔內(nèi)液體擴(kuò)散完畢或液面下降 4 將瓊脂板倒置于濕盒內(nèi) 37溫箱內(nèi)作用24-72小時(shí)觀察結(jié)果,五 結(jié)果判定 （一） 當(dāng)陽性血清與抗原孔之間出現(xiàn)清晰沉淀線 證明實(shí)驗(yàn)成立 （二） 如果被檢血清與抗原孔之間出現(xiàn)沉淀線 或陽 性血清的沉淀線向鄰近被檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎者，被檢血清判為陽性 （三） 如果被檢血清孔與抗原孔之間沒有沉淀線;而且陽性血清孔沉淀

10、線直向被檢血清孔則被檢血清判為陰性,血 清 平 板 凝 集 試 驗(yàn),一 原理 細(xì)菌性顆?？乖c相應(yīng)的抗體結(jié)合,在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)參與下, 經(jīng)過一段時(shí)間抗原顆粒相互凝集成肉眼可見團(tuán)快. 常用已知細(xì)菌性抗原檢測(cè)相應(yīng)的凝集抗體 凝集試驗(yàn)包括：試管凝集反應(yīng) 、平板凝集反應(yīng)全血平板凝集反應(yīng)、血清平板凝集反應(yīng)）.,適用范圍 雞白痢、雞傷寒 雞毒支原體、滑液囊支原體 雞副嗜血桿菌?。u傳染性鼻炎）,三 器材 凝集抗原、陽性、陰性血清 被檢血清，移液器（550ul） 載玻片，25燈箱,四 操作程序 （一）準(zhǔn)備 試驗(yàn)前20分鐘自4冰箱取出抗原; 陰、陽性血清和被檢血清; 使其達(dá)到室溫，并將抗原液振蕩均勻,（二）試驗(yàn)

11、過程 1. 取抗原液25ul滴于載玻片上 2 . 迅速在抗原液上滴加等量的被檢血清 3. 快速用牙簽將血清與抗原混勻 4. 并涂布成 2cm大小的片狀 5. 在燈箱附近不斷晃動(dòng)玻片2分鐘，觀察有無凝集,五 結(jié)果判定 2 分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集（背景透亮）為陽性;背景均勻一致呈混濁樣，無凝集者為陰性.,陰性,陽性,雞白痢沙門氏菌的平板凝集試驗(yàn)的觀察,新城疫病毒、禽流感病毒的分離和鑒定,一 病料的采集和處理 活動(dòng)物： 氣管、喉頭、呼吸道分泌物（拭子） 死動(dòng)物 ： 肝、脾、肺等內(nèi)臟用生理鹽水（肉湯） （含雙抗2000單位/ml） 制成12組織勻漿 4冰箱作用小時(shí)或過夜 轉(zhuǎn)分 離心分鐘 取上清液備用,二

12、雞胚接種 1 取9-11日齡SPF雞胚，每個(gè)樣接種5-10個(gè)雞胚 2 取上述處理的上清液0.2ml 接種于雞胚尿囊腔中 3 37培養(yǎng)4-7天 4 每天照蛋2次，棄去24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚 5 收集死胚及培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的活胚 放4冰箱中冷卻2小時(shí)以上（過夜） 6 收取尿囊液測(cè)定其HA活性（效價(jià)） 陰性者需傳代2次,三 病毒鑒定 禽流感病毒與其他血清型的副粘病毒 以及某些細(xì)菌支原體也具有血凝性 可用相應(yīng)特異陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn) 或全血平板凝集抑制試驗(yàn)進(jìn)行鑒定 新城疫血凝抑制試驗(yàn)禽流感 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)不同血清型禽流感血凝抑制試驗(yàn),四 新城疫病毒、禽流感病毒的致病力測(cè)定 （一） 雞胚平均致死時(shí)間（MDT）（

13、最小致死量） 1 將新鮮感染尿囊液進(jìn)行101-109稀釋 2 每個(gè)稀釋度接種5枚911天 SPF雞0.1ml/胚 3 置37培養(yǎng)。每日照蛋2次 4 連續(xù)觀察7天，記錄每個(gè)雞胚死亡時(shí)間 最小致死量為引起所有雞胚死亡最大稀釋度 MDT最小致死量引起雞胚死亡平均時(shí)間 強(qiáng) 毒60小時(shí) 中等毒力61-90小時(shí) 低等毒力90小時(shí),（二） 腦內(nèi)致病指數(shù)（IICP） 1、取凝集價(jià)在24以上的新鮮感染尿囊液 用生理鹽水10倍稀釋； 2、腦內(nèi)接種1日齡雛雞（24-40小時(shí)） 10只， 每只0.05ml； 3、 每24小時(shí)觀察一次，共觀察8天； 4、 每天觀察給雞打分，正常雞為0分； 病雞為1分；死雞為2分；雞每天

14、觀察仍記錄2分） IICP是每只雞8天所有觀察數(shù)值的平均數(shù)強(qiáng)毒力病毒ICPI為2，溫和毒數(shù)為0,(三） 靜脈致病指數(shù)（IVPI） 1 將HA高于24的新鮮感染尿囊液 用生理鹽水做10倍稀釋 2 給10只6周齡SPF雞靜脈接種0.1ml 3 每天觀察一次，共10天，每次觀察記錄正常雞為0，病雞1， 癱瘓雞、有神經(jīng)癥狀者為2， 死雞記作3（死雞以后每天仍記3） IVPI指每只雞10天內(nèi)觀察值的平均數(shù)， 溫和型和中等毒力者IVPI為0，強(qiáng)毒株為3,禽腦脊髓炎病毒的分離和鑒定,一 采樣 （一） 取發(fā)病典型的雛雞腦組織 （發(fā)病早期，不超過23天） 加含雙抗的生理鹽水制成1020懸液 （二） 4作用24小時(shí)， （三） 1500轉(zhuǎn)離心30分鐘，取上清液備用。,二 雞胚接種 1 取5-7日齡SPF雞胚5-10枚 2 卵黃接種 將雞胚垂直放于蛋托上 3 在氣室中央打孔， 用7#針頭垂直插入剩下1cm左右 4 接種0.2ml病毒液，封蠟 5 37繼續(xù)孵化11天12天，觀察結(jié)果,三 結(jié)果判定 1 自然感染的野毒不易使SPF雞胚出現(xiàn)病變 需要傳34代才能適應(yīng)雞胚出現(xiàn)病變 . 2 取半數(shù)雞胚打開觀察雞胚觀察 肌肉營養(yǎng)不良，腿肌運(yùn)動(dòng)性降低 腳趾彎曲等變化 3 另一半雞胚繼續(xù)孵化 出殼后10天內(nèi)便可見到典型AE癥狀出現(xiàn),四 病毒鑒定 1 將出現(xiàn)病變的雞胚（腦、胃腸道、胰腺） 通過一定的方法制