1、線性評(píng)價(jià)及分析測(cè)量范圍的確定,陳明 湖南 長沙,1,參考材料,CLSI EP6-A ：Evaluation of Linearity of Quantitative Analytical Methods; Approved Guide-Second Edition（美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)） 臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)P168 WS/T 408-2012 臨床化學(xué)設(shè)備線性評(píng)價(jià)指南（中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，2013-8-1實(shí)施）,2,概念,線性(Linearity)：在給定的測(cè)量范圍內(nèi)，使測(cè)定結(jié)果與樣本中分析物的量直接成比例的能力。此處的測(cè)定結(jié)果指最終的分析結(jié)果，而非儀器輸出的原始信號(hào)。 線性范圍

2、(Linear Range)：實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)最終分析結(jié)果為可接受的線性的濃度范圍，此時(shí)的非線性誤差應(yīng)低于允許誤差。 分析測(cè)量范圍(Analytical Measurement Range)：指患者樣本未經(jīng)任何處理（稀釋、濃縮或其他預(yù)處理），由檢測(cè)系統(tǒng)直接測(cè)量得到的可靠結(jié)果范圍，在此范圍內(nèi)一系列不同樣本分析物的測(cè)量值與其實(shí)際濃度（真值）呈線性比例關(guān)系。,3,檢測(cè)系統(tǒng)要求,實(shí)驗(yàn)操作人員要求：熟悉儀器操作、質(zhì)控、校準(zhǔn)、正確處理樣品。在進(jìn)行線性評(píng)價(jià)之前，檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)運(yùn)行一段時(shí)間。 檢測(cè)系統(tǒng)要求：儀器應(yīng)有較好的精密度及不存在明顯的攜帶污染。試劑在效期內(nèi)并儲(chǔ)存條件合格。宜采用與評(píng)價(jià)試劑配套的校準(zhǔn)品或經(jīng)

3、經(jīng)驗(yàn)證可用于此線性評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)的產(chǎn)品。,4,樣品濃度水平選擇,所選用濃度水平應(yīng)盡可能覆蓋整個(gè)預(yù)期測(cè)定范圍并包括與臨床有關(guān)的重要評(píng)價(jià)濃度，如最小測(cè)定濃度或線性范圍的最低限，不同的醫(yī)學(xué)決定水平，最大測(cè)定濃度或線性范圍的高限等。,5,樣品（濃度水平）數(shù)量 EP6-A,證實(shí)分析測(cè)量范圍有效性時(shí)：需5-7個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次。 驗(yàn)證聲明范圍或改良方法時(shí)：需7-9個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2-3次。 建立分析測(cè)量范圍時(shí)：需9-11個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定2-4次?？杀阮A(yù)期的分析測(cè)量范圍寬20-30%，以期檢測(cè)到“拐點(diǎn)”。,6,樣品（濃度水平）數(shù)量 WS/T 408-2012,驗(yàn)證：4-6個(gè)樣品，覆蓋線性

4、范圍，3-4次測(cè)定。 建立：9-11個(gè)樣品，3-4次測(cè)定。如欲發(fā)現(xiàn)最寬的濃度范圍，可將預(yù)期測(cè)量范圍加寬至130%，在此范圍內(nèi)選擇更多的濃度水平，然后逐漸減少數(shù)據(jù)點(diǎn)直至表現(xiàn)出線性關(guān)系。,7,樣品種類選擇,依據(jù)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的可能性，應(yīng)盡可能按以下順序選擇樣品種類 臨床混合樣品 用適當(dāng)稀釋液稀釋的臨床樣品（如血清等） 添加分析物的臨床樣品 用處理過的低濃度物質(zhì)或處理過的血清物質(zhì)稀釋的臨床樣品 校準(zhǔn)品、線性物質(zhì)、質(zhì)控品 使用生理鹽水稀釋的樣品 濃縮或過度稀釋的質(zhì)控品 水溶液 其它溶劑的溶液,8,樣品制備,高濃度樣品可通過在低濃度水平的患者樣品中添加分析物的方法制備。加入量盡可能少，原則上少于總體積的1

5、0%。 低濃度樣品可直接從患者樣本中收集，或經(jīng)透析、熱處理、層析等預(yù)處理而降低分析物濃度水平達(dá)到所需濃度。注意預(yù)處理不能改變分析物或基質(zhì)的理化特性。,9,樣品制備,樣品稀釋液應(yīng)選用廠家推薦或?qū)嶒?yàn)室證明可使用的產(chǎn)品，如5%牛血清白蛋白或人白蛋白溶液。 如用溶液作為樣品添加劑，添加體積應(yīng)小于10%，并注明溶劑。 避免溶血、脂血、黃疸等。 用接近于預(yù)期的分析測(cè)量范圍上限和下限（或測(cè)量低限）的兩個(gè)分析濃度的樣本配成所有樣本濃度。,10,添加分析物的建議原料,11,添加分析物的建議原料,12,樣品制備,13,濃度計(jì)算,如果高/低濃度混合血清的值已知，可依據(jù)公式C=C1V1C5V5 / V1V5計(jì)算各濃度

6、 如果高/低濃度混合血清的值未知，可將每種混合血清編碼。編碼可代表每個(gè)血清的相對(duì)濃度。對(duì)于等濃度間隔樣 品，編碼可用整數(shù)（如1、2、3、4、5等）代表連續(xù)樣品。本實(shí)驗(yàn)方案不需預(yù)先知道樣品濃度，在確定線性范圍時(shí)可使用樣品測(cè)定結(jié)果的均值。,14,濃度計(jì)算,可用計(jì)算濃度或標(biāo)定濃度作為X值，儀器測(cè)量結(jié)果或儀器輸出值（均值）作為Y值。 也可用相對(duì)濃度作為X值，如濃度間為等間隔，可用樣品編號(hào)（如1、2、3、4、5等）代表X值。 如所制備的樣品系列非等間隔，其濃度間的關(guān)系應(yīng)明確，在測(cè)定時(shí)可以這些間隔間的相對(duì)比值做為X值，此時(shí)的樣品編號(hào)可以不為整數(shù)。,15,實(shí)驗(yàn)程序,一般要求：實(shí)驗(yàn)人員必須熟練掌握儀器操作和維

7、護(hù)程序、樣本準(zhǔn)備方法和校準(zhǔn)。 全部實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)采集宜在同一試驗(yàn)批（run）內(nèi)或者相隔簡(jiǎn)短的實(shí)驗(yàn)批中完成（在一天內(nèi)完成）。樣本隨機(jī)排列。有顯著攜帶污染時(shí)，應(yīng)用空白隔開樣本。每個(gè)濃度樣本重復(fù)測(cè)定2-4次。記錄分析結(jié)果。,16,初步數(shù)據(jù)檢查 EP6-A,以樣本濃度或相對(duì)濃度為X軸，測(cè)定濃度為Y軸繪制散點(diǎn)圖，將各樣品測(cè)定均值畫在圖上，用手工或計(jì)算機(jī)方法將這些均值點(diǎn)連接起來，觀察各測(cè)定值與均值連線的大致偏差。 當(dāng)某個(gè)樣品的某測(cè)定值明顯偏離其它測(cè)定值時(shí)，目視判斷它是個(gè)離群點(diǎn)。 單個(gè)離群點(diǎn)可從數(shù)據(jù)組中剔除，如發(fā)現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上離群點(diǎn)應(yīng)考查造成誤差的可能原因，糾正后對(duì)整套樣品重新測(cè)定。,17,初步數(shù)據(jù)檢查 EP

8、6-A,目視檢查散點(diǎn)圖可很容易發(fā)現(xiàn)非線性或?qū)嶒?yàn)樣品濃度范圍過寬或過窄，同時(shí)還可以為后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法提供依據(jù)。,18,檢測(cè)離群點(diǎn)WS/T 408-2012,19,檢測(cè)離群點(diǎn),20,多項(xiàng)回歸分析,將測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸分析，得出一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)多項(xiàng)式，此步驟可用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（如SPSS, SAS）完成。,21,多項(xiàng)式回歸方程模式,一級(jí)多項(xiàng)式模型為直線，這是判斷某種方法是否為線性的最適方程。 二級(jí)多項(xiàng)式模型為一種拋物線反應(yīng)曲線，有增加趨勢(shì)（曲線上升）或減少趨勢(shì)（曲線下降）兩種。 三級(jí)多項(xiàng)式模型代表一種“S”形反應(yīng)曲線，在測(cè)量范圍的兩端呈非線性。,22,多項(xiàng)式回歸分析思路,第一步判斷用非

9、線性多項(xiàng)式擬合數(shù)據(jù)是否比線性好。 第二步判斷最適非線性模型與線性擬合之間的差值是否小于預(yù)先設(shè)定的該方法的允許偏差。,23,符號(hào)與縮略語,24,回歸方程的線性檢驗(yàn),t = bi / SEi bi-回歸系數(shù) SEi -每個(gè)非線性系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤 自由度 df=LRRdf L-樣本數(shù) R-每個(gè)樣本的測(cè)定次數(shù) Rdf-回歸自由度，即回歸方程中系數(shù)（包括b0）的個(gè)數(shù),25,回歸方程的線性檢驗(yàn),當(dāng)檢測(cè)到非線性時(shí)，通過計(jì)算回歸標(biāo)準(zhǔn)誤(sy.x)，確定最優(yōu)的二次或三次多項(xiàng)式回歸方程， sy.x是測(cè)量均值與回歸方程對(duì)應(yīng)值的差值量度，反應(yīng)樣本回歸系數(shù)與總體回歸系數(shù)之間的抽樣誤差。因而sy.x越小，說明該回歸方程越適合

10、數(shù)據(jù)組。,26,回歸方程的線性檢驗(yàn),多元回歸方程二階模式中b2為非線性系數(shù)，三階模式中b2和b3為非線性系數(shù)，每個(gè)SEi可由回歸計(jì)算程序得出。對(duì)非線性回歸系數(shù)b2和b3做 t 檢驗(yàn)，判斷回歸系數(shù)與0是否有顯著性差異。如回歸系數(shù)與0有顯著差異(P0.05)，則該組數(shù)據(jù)存在非線性。前兩個(gè)系數(shù)b0與b1因不反映非線性故不需檢驗(yàn)。,27,回歸方程的線性檢驗(yàn),如二級(jí)多項(xiàng)式L = 5，R = 2，Rdf = 4，df = 52-4 = 6。在t值表中尋找t界值（雙側(cè)檢驗(yàn)，=0.05），如非線性系數(shù)b2tt0.05(df)，則差異無顯著性（P0.05），數(shù)據(jù)組被認(rèn)為具線性。此時(shí)可對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行精密度檢驗(yàn)，精密

11、度符合線性判斷要求時(shí)，數(shù)據(jù)分析結(jié)束并得出結(jié)論為數(shù)據(jù)組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)線性或一階線性。如任一非線性系數(shù)具顯著性（P0.05），數(shù)據(jù)組則為非線性。此時(shí)應(yīng)進(jìn)行臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性與非線性檢驗(yàn)。,28,非線性程度判斷臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性與非線性檢驗(yàn),線性評(píng)價(jià)是為臨床服務(wù)。 多項(xiàng)式回歸是強(qiáng)調(diào)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判斷線性，沒有考慮臨床允許有一定的誤差。 臨床實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)廠家可根據(jù)臨床上對(duì)方法測(cè)定誤差的具體要求制定本室的線性判斷標(biāo)準(zhǔn)或稱允許誤差。 WS/T408-2012設(shè)定統(tǒng)計(jì)量PctBnd，對(duì)大多數(shù)分析物PctBnd取5%。,29,非線性程度判斷WS/T408-2012臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性與非線性檢驗(yàn),30,非線性程度判斷WS/T4

12、08-2012臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性與非線性檢驗(yàn),31,將ADL與臨界值表比較，ADL小于臨界值，判定為臨床可接受的非線性，即二階或三階線性。否則判定為臨床不可接受的非線性，即非線性。,32,P標(biāo)注P的表格表示最優(yōu)擬合方程的精密度太差，無法進(jìn)行線性判斷,33,非線性程度判斷-EP-6A,計(jì)算每一個(gè)濃度處的線性偏離(deviation from linearity.DL) DLip(xi) (b0bixi) x的取值范圍x1到xs， p(xi) 為最適多項(xiàng)式回歸模型在xi處的值，因而 DLi為在每個(gè)不同濃度處二次或三次多項(xiàng)式模型與一次多項(xiàng)式（線性）模型的差值，也即非線性模型與線性模型在每個(gè)濃度點(diǎn)的差值。

13、 DLi可為絕對(duì)值，或?qū)⒚總€(gè)DLi除以該濃度已知值或測(cè)量均值再乘以100%。,34,非線性程度判斷-EP-6A,將每個(gè)濃度的DLi與設(shè)定的誤差范圍比較，如DLi 設(shè)定誤差，則非線性誤差小于設(shè)定目標(biāo)，采用線性方式處理患者結(jié)果引入的誤差不超過臨床允許誤差，臨床上可接受。,35,非線性程度判斷-EP-6A,如果任一點(diǎn)超過設(shè)定誤差，則代表該點(diǎn)可能是非線性，可按以下兩種方法處理： 尋找非線性的原因：樣品準(zhǔn)備、干擾、儀器校準(zhǔn)等，進(jìn)行糾正。 觀察散點(diǎn)圖，如非線性點(diǎn)位置在兩端，可先刪除太大的點(diǎn)并重新進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但這樣會(huì)縮小線性范圍。,36,兩種方法比較,37,兩種方法比較,38,多項(xiàng)式回歸分析要求具有較高的

14、測(cè)量精密度，否則會(huì)降低統(tǒng)計(jì)功效。 采取對(duì)明顯的非線性不作判斷，剔除離群值，檢驗(yàn)測(cè)量數(shù)據(jù)的精密度的措施，達(dá)到有足夠統(tǒng)計(jì)功效的目的。,39,數(shù)據(jù)的精密度檢驗(yàn)WS/T408-2012,40,精密度判斷,41,精密度判斷EP6-A,42,精密度判斷EP6-A,如Sr不精密度設(shè)定目標(biāo)，則數(shù)據(jù)組精密度太低，不足以用來真實(shí)、可靠地評(píng)價(jià)線性關(guān)系。 檢查檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行糾正，或?qū)⒅貜?fù)測(cè)定次數(shù)增加一倍（4次）。,43,線性范圍報(bào)告（必報(bào)）,進(jìn)行線性評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)廠家名稱 被評(píng)價(jià)的方法或試劑名稱，批號(hào) 測(cè)定項(xiàng)目 線性范圍,44,線性范圍報(bào)告（如有條件可加報(bào)）,線性范圍低限及在此水平的允許誤差 線性范圍高限及在此水平

15、的允許誤差 測(cè)定項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)決定水平及在此水平的允許誤差,45,例1 ALT測(cè)定的線性評(píng)價(jià),ALT測(cè)量結(jié)果（單位為U/L）,46,47,線性評(píng)價(jià),一階方程b1假設(shè)檢驗(yàn)t值=72.872.228，差異具有顯著性。 二階方程b2假設(shè)檢驗(yàn)t值=0.912.262，差異不具有顯著性。 三階方程b2假設(shè)檢驗(yàn)t值=0.032.306，差異不具有顯著性。 b3假設(shè)檢驗(yàn)t值=0.122.306，差異不具有顯著性。 判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果為一階線性。,48,精密度檢驗(yàn)WS/T408-2012,49,精密度檢驗(yàn)WS/T408-2012,50,精密度檢驗(yàn)EP6-A,方法三：根據(jù)公式計(jì)算Sr 1.21%，如設(shè)定的不精密度為5%，

16、則該數(shù)據(jù)組不精密度符合要求。,51,結(jié)論,本檢測(cè)系統(tǒng)ALT在51075U/L的范圍內(nèi)為統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的線性關(guān)系或一階線性。,52,例2：鉀離子測(cè)定的線性評(píng)價(jià)（單位為mmol/L）,53,54,線性評(píng)價(jià),上表顯示三階方程系數(shù)b2有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），三階系數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），最優(yōu)擬合方程為二階方程，數(shù)據(jù)擬合結(jié)果是統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的非線性。,55,精密度檢驗(yàn)和非線性程度判斷(WS/T408-2012),56,非線性程度判斷(EP6-A),57,精密度檢驗(yàn)EP6-A,根據(jù)公式計(jì)算Sr 2.45%，如設(shè)定的不精密度為5%，則該數(shù)據(jù)組不精密度符合要求。,58,結(jié)論,本檢測(cè)系統(tǒng)鉀離子在0.709.10mmol/L的范圍內(nèi)為統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的二階線性并為臨床可接受線性關(guān)系。,59,例3：磷測(cè)定的線性評(píng)價(jià)