1、基因工程藥物,概念性問題,基因工程概念性問題,1、基因和基因組的概念 2、基因工程中常用的工具酶 3、基因工程克隆載體 4、基因治療與轉(zhuǎn)基因動物,1、基因和基因組,基因：基因是染色體上呈直線按順序排列的遺傳單位，基因是攜帶遺傳信息的結(jié)構(gòu)單位，又是控制遺傳性狀的功能單位?；虺幋a序列外還應(yīng)包括保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列及位于編碼區(qū)上游5端的啟動子非編碼序列、內(nèi)含子和位于編碼區(qū)下游3端的終止子非編碼序列。 編碼區(qū)是基因功能發(fā)揮的結(jié)構(gòu)基因（或稱功能基因），調(diào)控序列和啟動子起調(diào)控啟動作用，終止的非編碼區(qū)屬于調(diào)控基因。 染色體總長不到0.5m，而DNA分子總長可達數(shù)米。染色體上的基因為DNA分子。,1、

2、基因和基因組,基因組是表示某物種單倍體的總DNA，對于二倍體高等生物，其配子的DNA總和即為一組基因組。 重疊基因（overlapping genes）：不同基因的核苷酸序列有時為相鄰的兩個基因共用，將核苷酸彼此重疊的兩個基因稱為重疊基因。 病毒基因組 細菌基因組 真核生物基因組,病毒基因組的特點,結(jié)構(gòu)簡單，無細胞結(jié)構(gòu)?；蚪M由DNA或RNA組成，可為單鏈或雙鏈，亦可呈環(huán)狀或線狀。基因組小，含基因數(shù)少。 基因組中存在調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄單元。 有重疊基因存在。 以RNA為基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒。典型的逆轉(zhuǎn)錄病毒有三個基因，即由gag（核心蛋白）、pol（逆轉(zhuǎn)錄酶）和env（包膜蛋白）組成，其基因結(jié)構(gòu)如圖

3、所示：,病毒基因組的特點,RNA基因組的兩端含有U3RU5兩個完全相同的正向重復(fù)序列，從而在兩末端形成了長末端重復(fù)序列（LTR）。LTR為激活、增強和調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的重要區(qū)段。因此LTR在人類基因組中的整合也可促進其下游基因的活化和表達，如原癌基因被激活后致癌。,U3,U3,R,R,U5,U5,病毒DNA,LTR,LTR,gag,pol,env,3,5,DNA,+DNA,3,5,細菌基因組的特點,由一條雙鏈DNA組成，為無核仁、核膜的原核結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)基因通常是單拷貝基因。而rRNA基因則是多拷貝的。 細菌中的結(jié)構(gòu)基因中無內(nèi)含子，無核膜，一般是邊轉(zhuǎn)錄邊在胞漿中直接合成蛋白質(zhì)。 無基因重疊結(jié)構(gòu) D

4、NA分子中有多種功能調(diào)控區(qū)，如復(fù)制起始區(qū)、復(fù)制終止區(qū)、轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)及轉(zhuǎn)錄終止區(qū)等，這些區(qū)域常具有反向重復(fù)序列。,細菌基因組的特點,質(zhì)粒（plasmid）是染色體以外的遺傳物質(zhì)，是環(huán)狀的DNA分子。不同細菌中的質(zhì)粒大小不一（103105bp）。在酵母和其它真菌中也發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒。 質(zhì)粒DNA的功能類型有三種：（1）F質(zhì)粒（F因子）由稱性質(zhì)粒?？刂凭纬?，利于定居，質(zhì)?？捎尚跃珌磉M行質(zhì)粒傳遞和轉(zhuǎn)移；（2）R質(zhì)粒（抗藥性因子）能編碼一種或幾種抗菌素的抗性物質(zhì)；（3）col質(zhì)粒（大腸桿菌因子）質(zhì)粒中含有編碼大腸桿菌素的基因，編碼的大腸桿菌素可使近緣的細菌致死或抑制生長。有的可編碼毒素。,真核基因組的特點

5、,大而復(fù)雜，人的單倍體基因組為3109bp，比原核生物大數(shù)千倍，其體細胞基因組為雙倍體，即有2份同源的基因組。 存在大量低度、中度和高度重復(fù)序列 基因組中功能基因大多是不連續(xù)的，為斷裂基因（splitgene）中間被不編碼蛋白質(zhì)的插入序列內(nèi)含子所隔開。 基因組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū)，約占總DNA的90%。 基因組DNA大多與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，其中DNA約占35%，RNA占5%，其余的60%為組蛋白和非組蛋白。,真核基因組,C值和C值矛盾：一個單倍體基因組中的全部DNA量稱為該物種DNA的C值（C value）。 單拷貝序列：一部分與蛋白質(zhì)及酶類表達有關(guān) 中度重復(fù)序列：通常是非編碼序列，與單拷

6、貝基因間隔排列，少數(shù)成串排列在一個區(qū)域。 高度重復(fù)序列 多基因家族：、真核基因組中許多來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的基因在染色體上成串存在，這樣一組基因稱為基因家族（gene family）。,基因的新概念,移動基因（movable gene）又叫轉(zhuǎn)位因子（transposable elements），可以在染色體基因組上移動，甚至可在不同染色體間躍遷，故又稱跳躍基因（jumping gene），后來稱其為insertion sequences（現(xiàn)在一般叫IS elements）?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)在細菌中存在著三種類型的轉(zhuǎn)位因子，相對分子質(zhì)量小于2000bp的一般叫插入序列（IS），大于2000bp

7、的稱為轉(zhuǎn)位子（Transposon，Tn），第三種類型為噬菌體Mu和D108。,2、基因工程中常用的工具酶,基因的重組與分離涉及一系列相互關(guān)聯(lián)的酶促反應(yīng)。在眾多的核酸酶中，限制性核酸內(nèi)切酶（又稱限制酶，restriction enzyme）和DNA連接酶（ligase）的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，才真正使分子的體外切割和連接成為可能。 限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割雙鏈DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。它們主要是從原核生物中分離純化出來的。 在核酸內(nèi)切酶的作用下，侵入細菌的“外源DNA分子被切割成不同大小的片段，而細菌本身的DNA由于修飾酶的保護作用，可免于自身限制

8、酶的降解。,限制性核酸內(nèi)切酶分類和命名,分類：即、型酶,限制酶的命名,（1）用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母，組成的3個字母的略語表示寄主菌的物種名稱。例如大腸桿菌（escherichia coli）用Eco表示，流感嗜血菌（haemophilus influenzae）用Hin表示。 （2）用一個寫在右下方的標(biāo)注字母代表菌株或型，例如 EcoR。如果限制和修飾體系在遺傳上是由病毒或質(zhì)粒引起的，則在縮寫的寄主菌的種名右下方附加一個標(biāo)注字母，表示為染色體外成分。例如EcoR I, EcoP I。 （3）如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾體系，則以羅馬數(shù)字。如流感嗜血菌Rd菌株的

9、幾個限制與修飾體系分別表示為Hind I、Hind II、Hind III等。 （4）原先的命名現(xiàn)在得到簡化，原則為：把所有略語字寫成一行；命名酶名稱不再特別標(biāo)出限制酶或修飾酶，即略去R與M字母。,II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性,（1）在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子形成鏈的斷裂； （2）2個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對的； （3）斷裂的結(jié)果形成的DNA片段，也往往具有互補的單鏈延伸末端，但平末端例外。 絕大多數(shù)的II型限制酶都能識別由4、5、6或7個核苷酸組成的特定核苷酸序列。該序列稱為識別序列。,切割位點,C-C-G-C-G-G,切割位點,G

10、-G-C-G-C-C,5,3,3,5,對稱軸,DNA連接酶和DNA分子的體外連接,目前已知有3種方法可以用來在體外連接DNA片段：第一種是用DNA連接酶連接具有粘性末端的DNA 片段；第二種方法是用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段加上Poly（dA）-Poly(dT)尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來；第三種是，先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶連接。,其它工具酶,（1）大腸桿菌DNA聚合酶I（E. Coli DNA Pol I） DNA聚合酶I由兩種亞基組成，帶有3種酶活性。它的大亞基相對分子量為7900，帶有聚合活性和3外切核酸酶活

11、性，小亞基只有5外切核酸酶的活性。,其它工具酶,（2）DNA聚合酶I大片段（klenow酶） klenow酶的相對分子量為7600。是經(jīng)過Subtillisin（枯草桿菌）蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶，切除小亞基，只保留大亞基部分。所以這種酶具有DNA聚合酶的活性和3外切酶的活性，但是沒有5外切核酸酶活性。,其它工具酶,（3）T4DNA連接酶 此酶是從噬菌體T4感染的E. coli中分離的，和klenow大片段一樣，具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性。其外切酶活性比E. coli DNA聚合酶I的活性高200倍，此外，T4聚合酶有第三種活力取代反應(yīng)。,其它工具酶,（4）逆轉(zhuǎn)錄酶 這是一

12、種有效的轉(zhuǎn)錄RNA為DNA的酶。又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。其產(chǎn)物DNA又稱為cDNA，即互補DNA。最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒（AMV）的逆轉(zhuǎn)錄酶，由和兩條亞基組成，其相對分子質(zhì)量分別為65000和95000，這種酶具有聚合酶活性和外切割酶活性。（外切活性：如從DNA-RNA雜交鏈中特異性地降解RNA鏈，進而保留新合成的DNA鏈。,其它工具酶,（5）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶 從小牛胸腺或髓細胞中分離得到的，它催化DNA片段上的3-OH端加接脫氧核苷酸。合成的方向是從底物的5端向3端進行。 （6）核酸酶S1 是從半曲霉菌中分離得到，可以降解單鏈DNA和RNA，產(chǎn)生5磷酸化單核苷酸

13、或寡聚核苷酸。又稱單鏈特異的核酸酶。,其它工具酶,（7）核酸酶BAL31 從乳白短桿菌細胞中分離的。它能以漸進的方式從線型DNA分子的3、5兩邊同時降解，形成小的寡聚核苷酸片段或單核苷酸。 在基因工程中可被用于組建DNA的物理圖譜以及造成克隆DNA分子的末端缺失。,其它工具酶,（8）外切核酸酶III 從大腸桿菌中分離得到，功能是將帶有3-OH末端的雙鏈DNA從3到5端方向切除，產(chǎn)生5單核苷酸。此外該酶還帶有內(nèi)切核酸酶活性、RNaseH活性和3磷酸酶活性。 在基因工程中制備單鏈DNA，以便用作DNA聚合酶反應(yīng)的DNA模板； 在基因工程中制備對DNA有特異性的探針。,其它工具酶,（9）T4多聚核苷

14、酸激酶 此酶能將ATP上的位磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5-OH上，酶作用底物是 單鏈或雙鏈帶有5-OH末端的DNA或RNA。,其它工具酶,（10）堿性磷酸酶 從細菌中分離得到的堿性磷酸酶稱為BAP酶，從小牛內(nèi)臟中分離制備的酶稱為CAP酶。該酶的功能是以單鏈或雙鏈DNA、RNA為基質(zhì)，將DNA或RNA片段5端的磷酸切除。,其它工具酶,（11）甲基化酶 大部分大腸桿菌菌株中含有兩種與DNA甲基化作用有關(guān)的酶，有dam甲基化酶和dcm甲基化酶。,3、基因克隆載體,基因工程中所用的載體，主要有5類：a、質(zhì)粒，主要指人工構(gòu)建的質(zhì)粒；b、噬菌體的衍生物；c、cosmid；d、單鏈DNA噬菌體M13；e、動物病毒。 載體的本質(zhì)是DNA（少數(shù)為RNA）。,質(zhì)粒,細菌質(zhì)粒是存在于細胞質(zhì)中的一類獨立于染色體之外的一種遺傳成