1、細菌間的基因轉(zhuǎn)移(Transfer of Genes between Bacteria),宣勁松 北京科技大學(xué),本節(jié)重點： 1、細菌和病毒的四種遺傳分析方法： 轉(zhuǎn)化、接合、性導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)。 2、掌握F+、F、F的特點。 3、理解和掌握中斷雜交的原理。,一、細菌和病毒遺傳研究的意義,(一) 細菌 1、大?。杭毎^小、長約12 (11/1000mm)、寬約0.5； 2、結(jié)構(gòu)：鞭毛、細胞壁、質(zhì)膜、 間體、核質(zhì)體、核糖體 3、遺傳物質(zhì)：單個主染色體、 一個或多個小染色體(質(zhì)粒) 4、涂布和繁殖：每個細胞在較短 時間內(nèi)(如一夜)能裂殖到107個 子細胞成為肉眼可見的菌落 或克隆(clone)。,5、生理特性

2、突變： 營養(yǎng)缺陷型： 喪失合成某種營養(yǎng)物質(zhì)能力，不能在基本培養(yǎng)基上生長； 原養(yǎng)型：野生菌株則可在基本培養(yǎng)基上生長。 用不同的選擇性培養(yǎng)基測知突變的特性。 抗性突變型： 如抗藥性或抗感染性。 例如：青霉素(penr)抗性突變的菌落。,(二) 病毒 單倍體，僅一條染色體。病毒蛋白質(zhì)外殼核酸。 病毒分類： 寄主：動物、植物、細菌等； 遺傳物質(zhì)：DNA 或RNA。,煙草花葉病毒 腺病毒 T4 噬菌體 愛滋病病毒 RNA DNA DNA RNA,(三) 細菌和病毒在遺傳學(xué)研究中的重要性 1、世代周期短： 大腸桿菌(E.coli)20分鐘可繁殖一代。 2、便于管理和生化分析： 個體小，一般在1至幾之間，操

3、作管理方便。 3、便于研究基因突變： 裸露的DNA分子(有的病毒為RNA分子)，容易受環(huán)境條件的影響而發(fā)生突變；單倍體生物，不存在顯性掩蓋隱性問題，隱性突變也能表現(xiàn)出來。 4、便于研究基因的作用： 繁殖迅速，易檢出營養(yǎng)缺陷型突變，有利于從生化角度來研究基因的作用。,5、便于研究基因重組： 細菌具有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合作用，可以進行精密的遺傳分析。 6、便于研究基因結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機制： 細菌和病毒的遺傳物質(zhì)簡單，易于進行基因定位、結(jié)構(gòu)分析和分離，基因的表達調(diào)控也適于采用生理生化的方法進行深入研究。 7、便于進行遺傳操作： 染色體結(jié)構(gòu)簡單，沒有組蛋白和其它蛋白的結(jié)合，更宜于進行遺傳工程的操作。,二、

4、細菌的遺傳學(xué)分析,(一) 細菌基因組的特點 1、不具備明顯的核結(jié)構(gòu)，只有DNA的集中區(qū)，為擬核； 2、基因組較小，只有一條環(huán)狀染色體，一個復(fù)制起點，一個基因組就是一個復(fù)制子； 3、染色體不與組蛋白結(jié)合； 4、基因的結(jié)構(gòu)簡練，重復(fù)序列和不編碼序列很少，大部分為功能基因；無斷裂基因，不含內(nèi)含子；,5、基因的調(diào)控方式多種多樣； 6、功能密切相關(guān)的基因常高度集中，越是簡單的生物，集中程度越高； 7、存在轉(zhuǎn)錄單元； 8、常通過結(jié)合方式傳遞遺傳物質(zhì)。,A map of the E. coli genome, showing selected genes.,(二) 大腸桿菌中的質(zhì)粒 1、質(zhì)粒(plasmid

5、)：是獨立于細菌染色體外能進行自主復(fù)制的小型環(huán)狀裸露的DNA分子。 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)大致由3部分組成： 轉(zhuǎn)移區(qū)(transfer region, tra)和轉(zhuǎn)移起點ori：長約33kb，最少含有22個基因，為所有轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄所必須的，并參與調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄； 自我復(fù)制區(qū)(rep)：由3個位點組成，即正常的復(fù)制起點oriV、復(fù)制基因frp、不親和性基因inc，該區(qū)域直接關(guān)系到質(zhì)粒的自身復(fù)制； 插入?yún)^(qū)(insertion region)：可直接與細菌染色體同源區(qū)段配對，發(fā)生重組，插入到細菌染色體中。,2、大腸桿菌的質(zhì)粒按表型效應(yīng)可分為3類： (1) 致育因子(fertility factor，F(xiàn)因子

6、)： 這是一種能使細菌致育的因子，其上所帶的基因能使細菌在表面產(chǎn)生一種性纖毛。帶有F因子的細菌菌株稱為F，而不帶F因子的菌株為F菌株。 F因子為一個小的雙鏈閉合環(huán)狀DNA，94.5kb，約為細菌染色體DNA的2 ；約含4060個蛋白質(zhì)基因；24個/細胞(F菌株)。,(2) R因子(抗性因子) 包括抗藥性及抗某些金屬質(zhì)粒，R因子幾乎在所有細菌中都存在，大小也從幾kb至幾十kb不等。 在基因工程中常利用質(zhì)粒的這種抗性特性用作外源基因載體，便于篩選。 (3)大腸桿菌素原因子(col因子) 含有可以編碼大腸桿菌素的基因，而大腸桿菌素可用于專門殺死其它腸道細菌。,三、細菌間的基因轉(zhuǎn)移,遺傳物質(zhì)在細菌中有

7、三種轉(zhuǎn)移形式： 轉(zhuǎn)化(transformation) 接合(conjugation) 轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction),這三種轉(zhuǎn)移形式的共同特點是： 1、單方向轉(zhuǎn)移； 2、都產(chǎn)生部分二倍體； 3、基因只有整合到環(huán)狀染色體上才能穩(wěn)定地遺傳。,(一) 轉(zhuǎn)化(transformation),1、轉(zhuǎn)化(transformation)：某些細菌通過其細胞膜攝取周圍供體的染色體片段，將此外源DNA片段通過重組整合到自己染色體組的過程。 1928年，格里費斯(Griffith F.) 在肺炎雙球菌中首次發(fā)現(xiàn)細菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。 1944年，艾弗里(Avery O. T.) 進行肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗； 證實細菌轉(zhuǎn)化因

8、子是DNA； 轉(zhuǎn)化是細菌交換基因的方法之一。 2、轉(zhuǎn)化的條件：細菌活躍攝取外源DNA分子； 具備重組程序所必需的酶。,外源的DNA片段一般是人工抽提的，傳遞時不需要載體，通過改變細胞膜的通透性使外源DNA片段進入細胞，整合到基因組中，改變基因型。 在細菌中，轉(zhuǎn)化是裸露的非病毒DNA導(dǎo)入細胞的過程。,3、轉(zhuǎn)化DNA的攝取和整合過程： 結(jié)合與穿入： DNA分子結(jié)合在接受座位上(可逆)，可被DNA酶降解；接受座位飽和性。 DNA攝取(不可逆)，不受DNA酶破壞。 穿入后，由外切酶或DNA移位酶降解其中一條鏈。 聯(lián)會： 按各個位點與其相應(yīng)的受體DNA片段聯(lián)會。親緣關(guān)系越遠，聯(lián)會越小、轉(zhuǎn)化的可能性越小。

9、,整合(重組)： 是指單鏈的轉(zhuǎn)化DNA與受體DNA對應(yīng)位點的置換穩(wěn)定地進入到受體DNA。 對同源DNA具有特異性。異源DNA，視親緣關(guān)系遠近也可發(fā)生不同頻率整合。,4、轉(zhuǎn)染(transfection)：是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式，特指離體的噬菌體DNA作為外源DNA感染感受態(tài)細菌并在其中表達的過程。,5、通過轉(zhuǎn)化可以測定基因的連鎖、基因的排列順序以及圖距：利用共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象研究供體DNA上兩個基因的連鎖情況及其圖距。 單交換時，染色體開環(huán)易降解，故不存在單交換類型； 只有雙交換和偶數(shù)的多交換才有效。,(二) 接合(conjugation)： 1、概念：是指原核生物的遺傳物質(zhì)從供體(donor)轉(zhuǎn)移到受體

10、(receptor)內(nèi)的過程。 特點：需通過細胞的直接接觸。,2、F 因子的三種狀態(tài)： 以大腸桿菌為例： 未攜帶F因子的菌株為受體菌或雌性(F菌株) ，用F表示； 攜帶一個自主狀態(tài)F因子的菌株稱為供體菌或雄性(F菌株)，用F表示； 含有一個整合到自己染色體內(nèi)的F因子，即Hfr菌株(high frequence recombination)。,自主狀態(tài)的F 因子獨立進行分裂。,F菌株與Hfr菌株的比較： 相同點： 都含有F因子，細胞的表面有性纖毛； 都能與F菌株雜交，但F與F之間不能雜交。 不同點：,F菌株與Hfr菌株可以互相轉(zhuǎn)化，F(xiàn)因子經(jīng)交換可以整合到細菌染色體上，也可以通過原位交換從染色體上

11、脫落下來。,3、 F 因子的傳遞： F 因子中有形成F性傘毛(F pilus)的基因接合管F細胞中的F因子由接合管向F傳遞F受體變成F。,4、Hfr細胞的形成及染色體的轉(zhuǎn)移 F因子整合到細菌染色體上(FHfr細胞)，其繁殖與細菌染色體同步進行。 此時，細菌基因的重組頻率增加4倍以上，染色體上整合有F因子的菌株，稱為Hfr菌株。 在Hfr F結(jié)合時，細菌染色體由一小段單鏈的F因子為前導(dǎo)而轉(zhuǎn)移到F受體邊進入邊合成。一般僅小部分細菌染色體能夠轉(zhuǎn)入，接合中斷受體細胞為F，F(xiàn)因子仍留在供體內(nèi)。,5、中斷雜交實驗 由F. Jacob和E. Wollman(1956)首創(chuàng)的。 中斷雜交作圖 (interru

12、pted mating mapping)：是一種繪制大腸桿菌物理圖譜的方法。將Hfr F雜交，在混合后不同時間進行攪拌，以使接合管斷裂，中止染色體向受體細胞轉(zhuǎn)移。越是排在前面的基因進入受體菌的機會越高，反之排在離起點較后的基因進入受體菌的機會越低，因此用不同時間來中斷雜交，就能推斷出基因的順序。 Hfr菌株與F菌株混合培養(yǎng)。 Hfr菌株：strs a+ b+ c+ d+ 對鏈霉素敏感 F-菌株：strr a- b- c- d- 抗鏈霉素,實例： Hfr菌株：蘇氨酸(thr+)、亮氨酸(leu+)、抗疊氮化物(azir)、抗T1噬菌體(tonr)、半乳糖(galb+)、乳糖(lac+)。 F-菌

13、株：thr-、leu-、azis、tons、galb-、lac-型。 8分鐘時：thr+進入F-細胞； 8.5分鐘時：leu+進入F-細胞； 9分鐘時：出現(xiàn)疊氮化物抗性的菌落，少數(shù)azir基因進入F-細胞； 11分鐘時：出現(xiàn)抗噬菌體T1的F-細菌； 18和25分鐘時：分別出現(xiàn)乳糖和半乳糖發(fā)酵基因，即lac+和galb+進入F-細胞。, 重組體中各標(biāo)志基因進入F- 細胞中時間不同，達到最高水平的時間也不同； 隨時間的推遲，某個基因的重組率增加；一定程度后，重組率便不再增加。 如：10tonr首次出現(xiàn)， 15時40%、25后80%。 Hfr中基因是按一定的線性順序依次進入F-菌株的。,大腸桿菌Hf

14、r： thr+leu+lac+gal+azistonsstrs F： thrleulacgalazir tonr strr 的結(jié)果,用一種大腸桿菌的不同Hfr菌株進行中斷雜交實驗，作出連鎖圖，其基因向F-細胞轉(zhuǎn)移的順序不同。,轉(zhuǎn)移的順序是不是隨機？,Hfr1和HfrAB312菌系的中斷雜交試驗及其連鎖圖：,結(jié)束 開始,結(jié)束 開始,差異：不同Hfr菌株轉(zhuǎn)移的原點(O)和轉(zhuǎn)移方向不同。 進一步說明F因子和細菌染色體都是環(huán)狀。,(三) 性導(dǎo)(sexduction) 性導(dǎo)：指接合時由F因子所攜帶的外源DNA整合到細菌染色體的過程。 F 因子整合過程： 可逆：發(fā)生環(huán)出時，F(xiàn)因子又可重新離開染色體。,F

15、因子偶爾在環(huán)出時不夠準(zhǔn)確，會攜帶出染色體上的一些基因，這種因子稱為F因子。 F因子攜帶染色體的片段大小：從一個標(biāo)準(zhǔn)基因到半個細菌染色體。,F因子使細菌帶有某些 突出的特點： F因子轉(zhuǎn)移基因頻率極 高，如同F(xiàn)+因子轉(zhuǎn)移頻率； F因子自然整合率極高， 并且整合在一定的座位上。 攜帶與細菌染色體一樣 的同源區(qū)段；而正常F因子 可在不同座位整合。,性導(dǎo)在大腸桿菌遺傳研究中的作用： 分離出大量F因子(每個F因子攜帶有不同大腸桿菌基因) 利用不同基因在一起的并發(fā)性導(dǎo)的頻率來作圖； 通過性導(dǎo)產(chǎn)生部分二倍體確定等位基因位置、顯隱性關(guān)系； 性導(dǎo)形成的部分二倍體可用作互補測驗確定兩個突變類型是否屬于同一個基因。,(四) 轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction) 1、概念：指以噬菌體為媒介進行的細菌遺傳物質(zhì)重組，是細菌遺傳物質(zhì)傳遞和交換方式之一。 2、特點： 以噬菌體為媒介細菌的一段染色體被錯誤地包裝在噬菌體的蛋白質(zhì)外殼內(nèi)通過感染轉(zhuǎn)移到另一個受體細胞內(nèi)。 感染細菌的能力決定于噬菌體的蛋白質(zhì)外殼。,3、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(general transduction)： 作用：可轉(zhuǎn)導(dǎo)細菌染色體組的任何部分。錯誤包裹模型： 轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒：把細菌染色體片段包裝