1、1,5端加帽(cap)和3端多聚腺苷酸化(polyA)的調(diào)控意義 mRNA的選擇剪接(alternative splicing)對基因表達(dá)的調(diào)控 mRNA 運(yùn)輸?shù)目刂?轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,P256,2,（一）“戴帽安尾（穿靴）”（核內(nèi)）5加帽和多聚腺苷酸化及其調(diào)控意義 1.mRNA caping5加上 GpppmNP帽子，tailing 加上AA（50200bp）尾巴。 意義（1）保護(hù)作用保護(hù)mRNA免受核酸酶降解， （2）標(biāo)識作用為翻譯提供識別位點(diǎn)（CBP）。 2.rRNA 不易被降解的機(jī)理可能是因?yàn)槠浣M成核糖體是在核內(nèi)組裝的。 3.tRNA 合成后形成特殊的空間結(jié)構(gòu)（三葉草，倒L），可能抵抗

2、降解，半壽期長。,3,4,hnRNA內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的堿基順序具有最強(qiáng)的保守性,5GTAG 3,5,（二）mRNA的選擇剪接對基因表達(dá)的調(diào)控作用 1. mRNA的選擇剪接有多種方式,P259,6,7,2. 可變剪接的調(diào)控機(jī)制, SR蛋白家族的調(diào)控 剪接體的形成與多種蛋白質(zhì)和RNA復(fù)合體密切相關(guān)。在可變剪接上保守的SR磷蛋白家族因子的參與起重要作用。 SR蛋白家族以不同的質(zhì)的組成與量的差異選擇特定的mRNA前體剪接位點(diǎn)，不同的SR家族蛋白對適當(dāng)?shù)膍RNA前體可以誘導(dǎo)出不同選擇的剪接方式，在選擇剪接上起決定作用。,8, RNP的調(diào)節(jié) hnRNP-A1在不同組織中的含量變化很大，不參與組成性剪接。在選

3、擇5和3剪接點(diǎn)時具有可變剪接活性，成為參與可變剪接的調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)與SR蛋白共同調(diào)節(jié)組織特異性的剪接。 U5hnRNP在酵母中參與5剪接點(diǎn)突變的可變剪接。,9, 外顯子限定模型 真核細(xì)胞mRNA前體中內(nèi)含子遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外顯子，5與3剪接位點(diǎn)可以跨越數(shù)萬個核苷酸準(zhǔn)確地組合在剪接體中。 有證據(jù)表明，在前速激肽原mRNA前體的可變剪接中，外顯子下游的5剪接位點(diǎn)可影響其上游內(nèi)含子3的剪接。,10,選擇剪接對基因表達(dá)的調(diào)控作用（實(shí)例） （1）Bax基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的選擇剪接 Bax基因編碼產(chǎn)物是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的分子，（Bax/Bcl2調(diào)亡） Bax編碼產(chǎn)生的Pr.有幾種（、等），結(jié)構(gòu)略有差異，差異的產(chǎn)生來自m

4、RNA的選擇性剪接。 Bax 保留全部（6個）外顯子共192個密碼子譯出192AA多肽 Bax 保留全部外顯子和第5個內(nèi)含子（含終止碼） 共218個密碼子。 Bax 保留1、3、4、5、6外顯子，刪除第2個外顯子譯出151AA多肽。,11,（2）選擇剪接產(chǎn)生的IBr NF- B是非廣泛存在的方式作用因子可與基因上游啟動子元件或增加子內(nèi)部的 B元件結(jié)合而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。 NF- B與I Br結(jié)合時以無活性NF B/I Br復(fù)合體（105KD） 存在于胞漿 I Br基因表達(dá)時通過選擇剪接刪除其mRNA中的178個或67個密碼子閱讀框移動產(chǎn)生2種具有新C端Pr.異構(gòu)體即I Br1和I Br2 2者缺失

5、了1個蛋白激酶A位該位點(diǎn)磷酸化調(diào)節(jié)I Br活性。 剪接產(chǎn)生I Br異構(gòu)體有可能使NF- B對胞內(nèi)作出不同響應(yīng)，尚在研究中。,12,13,（三） RNA編輯,RNA編輯（RNA editing）是在RNA分子上出現(xiàn)的一種修飾現(xiàn)象。主要指mRNA在轉(zhuǎn)錄后因插入、缺失或核苷酸的替換，改變了DNA模板來源的遺傳信息，從而翻譯出氨基酸序列不同的多種蛋白質(zhì)。 RNA編輯似乎是中心法則的例外。編輯擴(kuò)大了遺傳信息，也可能是生物適應(yīng)的一種保護(hù)措施。,P260,14,1. 核苷酸的替換, U替換 最典型的例子是載脂蛋白B的RNA編輯。U替換使Apo-B 100 CAA編碼的谷氨酰胺突變?yōu)閁AA的終止密碼子，產(chǎn)生編

6、碼Apo-B48的mRNA。在蛋白質(zhì)水平上只保留了Apo-B100分子N端脂蛋白裝配結(jié)構(gòu)域，缺少了C端低密度脂蛋白受體結(jié)合區(qū)。,15,16, AI替換 在珠蛋白、c-Myc、成纖維細(xì)胞生長因子基因中都有因AI替換使互補(bǔ)鏈的U被RNA酶A水解的現(xiàn)象。,17,2. 可讀框的改變,可讀框的改變主要是核苷酸的插入或缺失。 G或C的插入則往往是因?yàn)槟０迳线B續(xù)幾個C（或G）之后，互補(bǔ)鏈因一種滑動力而被添加到RNA中。,18,19,20,3. 向?qū)NA,向?qū)NA（gRNA）是一種線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的短RNA（約5570核苷酸），能以正常堿基配對或GU配對的方式，選擇其5末端“錨區(qū)”在mRNA上的互補(bǔ)序列，為隨

7、后插入或缺失U提供模板。,21,22,23,（四）mRNA運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控mRNA運(yùn)輸是受控制的。 1.3H-udR顯示約20%mRNA 胞漿，核內(nèi)RNA約在1小時內(nèi)降解成小片段 2.核孔9nm，但可運(yùn)輸9nm顆粒（如核糖體15nm，在核內(nèi)組裝 入胞作用） 用20nm金顆粒（gold sphere）包裝小RNA（如tRNA或5sRNA） 注射到蛙卵（frogoocyte） 可迅速過核孔到胞漿。但注射入漿則不能入核說明mRNA主動運(yùn)輸入胞，但機(jī)制不清楚。,P261,24,翻譯起始的調(diào)控 未受精卵：隱蔽mRNA(masked mRNA)；受精：招募因子(recruitment factor)，激活隱蔽m

8、RNA 阻遏蛋白的調(diào)控：鐵結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白(regulatory iron-binding protein) 翻譯起始因子的調(diào)控：eIF-2，血紅素對珠蛋白合成的調(diào)節(jié) 5AUG對翻譯的調(diào)控作用：減少正常AUG啟動翻譯的作用，使翻譯維持在較低水平 mRNA5 端非編碼區(qū)長度對翻譯的影響,翻譯水平的調(diào)控,25,翻譯水平的調(diào)控,原核生物mRNA的半衰期很短，在翻譯水平上的調(diào)控對于基因表達(dá)的影響也很小。mRNA的二級結(jié)構(gòu)控制著翻譯的起始，核糖體蛋白的自體控制對蛋白質(zhì)的合成起抑制作用。 真核生物mRNA的半衰期比原核生物長的多，因此翻譯過程受調(diào)控的機(jī)會也較多。,26,翻譯水平的調(diào)控是真核生物基因表達(dá)多級調(diào)控

9、的重要環(huán)節(jié)之一。真核生物翻譯水平調(diào)控最普遍的機(jī)制是起始因子的磷酸化。 蛋白質(zhì)合成裝置各元件裝配活力的改變是導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯速率變化的主要因素。翻譯的速度和細(xì)胞生長的速度是密切協(xié)調(diào)的。,27,一、翻譯因子磷酸化調(diào)控,蛋白質(zhì)合成因子的磷酸化狀態(tài)與其對蛋白質(zhì)生物合成的激活或抑制作用密切相關(guān)。 1 eIF-4F通過亞單位的可逆磷酸化對蛋白質(zhì)生物合成進(jìn)行調(diào)控。 eIF-4E()和eIF-4G(/P220)亞基的磷酸化對蛋白質(zhì)的生物合成有激活作用。,28,29,2其他因子磷酸化對翻譯的激活作用 eIF-4B在促有絲分裂劑作用下，隨eIF-4F和核糖體蛋白S6一起，在細(xì)胞內(nèi)被磷酸化，激活起始因子eIF-4A和

10、eIf-4B的活性。 3eIF-2的磷酸化對翻譯的抑制作用 eIF-2亞基的磷酸化會導(dǎo)致eIF-2與eIF-2B緊密結(jié)合，直接影響了eIF-2的再利用，引起翻譯起始作用受阻，從而抑制蛋白質(zhì)的生物合成。,30,阻遏Pr.的調(diào)控作用 進(jìn)入胞漿并非所有的mRNA分子立即與核糖體結(jié)合翻譯成Pr. 一些特定的翻譯抑制Pr. 可結(jié)合到mRNA5,抑制翻譯。如： 鐵Pr.（ferritin）mRNA5端非編碼區(qū)約30個核甘酸序列稱為鐵反應(yīng)元件（iron-response element） 可折疊成1個莖環(huán)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)） 可結(jié)合1個鐵結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白（regulatoryiron-binding pro）。,31,

11、3,3,（1）有鐵不抑制，快譯運(yùn)輸工具。 （2）無鐵結(jié)合可運(yùn)鐵結(jié)合Pr.結(jié)合mRNA 抑制翻譯。,鐵結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白,32,真核生物肽鏈合成起始過程,33,34,35,翻譯起始因子(eIF2)的調(diào)控,36,(2)翻譯起始因子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的速度,37,5-AuG對翻譯的調(diào)控作用 （1）按Pr.生物合成模型，90%真核mRNA符合第1AUG規(guī)律譯出正常Pr. （2）5AUG可以減少正常AUG翻譯起始作用使翻譯維持在較低水平。原癌基因中是控制原癌基因表達(dá)的重要因素缺失導(dǎo)致某些原癌基因翻譯激活。,38,mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié) 3端非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)影響其穩(wěn)定性：3端富含A和U的結(jié)構(gòu)，引起mRNA 不穩(wěn)定 蠶蛹羽化

12、成蛾后，需大量蛋白水解酶溶解蠶絲蛋白，mRNA半衰期達(dá)100小時，其他僅2.5小時,翻譯水平的調(diào)控,39,mRNA 降解的機(jī)制,40,小分子RNA（lin-4）對翻譯水平影響 Lin-14核Pr.調(diào)控生長發(fā)育的時間選擇 Lin-4產(chǎn)生2個小分子RNA：1個長度22個核苷酸，另1個在3端延長至40個核苷酸 Lin-4RNA結(jié)合Lin14mRNA3UTR中的特異順序去掉這種順序mRNA就不會被抑制翻譯。,小分子RNA對翻譯水平的影響,41,新生肽鏈的水解：酶解 肽鏈N端的第一個氨基酸：穩(wěn)定化氨基酸（Met、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、Gly、Pro）與去穩(wěn)定氨基酸 肽鏈中氨基酸的共價修

13、飾：磷酸化、甲基化、酰基化 通過信號肽(signal peptide)分揀、運(yùn)輸、定位,翻譯后水平的調(diào)控,42,蛋白質(zhì)合成后的靶向輸送（ protein targeting）,蛋白質(zhì)合成后的去向 留在胞漿 進(jìn)入核、線粒體或其它細(xì)胞器 分泌至體液，輸送至靶器官 靶向輸送-蛋白質(zhì)合成后，定向地到達(dá)其執(zhí)行功能的目標(biāo)地點(diǎn),43,分泌性蛋白質(zhì)(secretory proteins) 穿過合成所在的細(xì)胞到其它組織細(xì)胞去的蛋白質(zhì) 信號肽(signal peptide) N-端的一段疏水氨基酸 1040個氨基酸 把合成的蛋白質(zhì)移向胞膜并與胞膜結(jié)合，然后把合成的蛋白質(zhì)送出胞外,44,分泌性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制,SR

14、P: signal recognition particles,45,信號肽識別顆粒,信號肽(signal peptide),46,外膜轉(zhuǎn)運(yùn)體,內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體,線粒體蛋白的靶向輸送,47,細(xì)胞核蛋白的靶向輸送,48,分子生物學(xué) Molecular Biology,核酸的分子雜交 Nucleic Acid Hybridization,Department of biochemistry and molecular biology,49,DNA和RNA的堿基核苷和相應(yīng)的核苷酸,50,核苷酸之間連接,51,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),52,Base pairing occurs in duplex DNA and

15、 also in intra- and inter-molecular interactions in single-stranded RNA (or DNA).,53,Content of Table,一、核酸分子雜交技術(shù)的原理 二、核酸探針的制備 三、核酸探針的標(biāo)記 四、核酸分子雜交技術(shù) 五、DNA芯片技術(shù),54,一、核酸分子雜交技術(shù)的原理,有互補(bǔ)特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時，其相應(yīng)同源區(qū)段將會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。 如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合適的標(biāo)記物（如放射性同位素、生物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe), 與變性后的單鏈基因組DNA或RNA等進(jìn)行

16、雜交。 用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測出來，就可確定靶核苷酸序列的拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等。,55,56,57,DNA變性是指核酸雙螺旋堿基對的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，從而使核酸的天然構(gòu)象和性質(zhì)發(fā)生改變。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。 凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性。,58,溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結(jié)構(gòu)，變性后代之以柔軟而松散的無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA粘度因此而明顯下降。 溶液旋光性發(fā)生改變。變性后整個DNA分子的對稱性及分子局

17、部的構(gòu)性改變，使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。 增色效應(yīng)。指變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強(qiáng)的效應(yīng)。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè)，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。,59,復(fù)性指變性DNA 在適當(dāng)條件下,二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象,它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性,此過程稱之為 退火(annealing)。這一術(shù)語也用以描述雜交核酸分子的形成。DNA的復(fù)性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。,60,應(yīng) 用： 1）檢測特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系； 2）用來揭示核

18、酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。,61,影響雜交的因素,核酸分子的濃度和長度 溫度 離子強(qiáng)度 雜交液中的甲酰胺 核酸分子的復(fù)雜性 非特異性雜交反應(yīng),62,1、核酸分子的濃度和長度： 濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g，濃度 過高影響雜交效率,63,2、溫度： （1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低 2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺 降低Tm值 （3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm 值低5,64,3、離子強(qiáng)度： （1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交

19、率增加 （2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度,65,4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在3542 雜交 （2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68雜交,66,5、核酸分子的復(fù)雜性： （1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度 （2）Cot與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比 （3）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性,67,6、非特異性

20、雜交反應(yīng)： （1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對探針的非特異性吸附 （2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉,68,常用于預(yù)雜交的封閉物,變性的非特異性DNA：常用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA。當(dāng)與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個背景覆蓋一層。由于它們與探針無同源性，在交雜反應(yīng)中可大大減少探針的非特異性結(jié)合，使背影清晰。 高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點(diǎn)的能力。一般常用小牛血清白蛋白。,Home,69,二、核酸探針的制備,探針（Probe

21、): 一段帶有檢測標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。,70,理想的探針,1.要加以標(biāo)記、帶有示蹤物，便于雜交后檢測和鑒定雜交分子。 2.應(yīng)是單鏈，若為雙鏈用前需要先行變性為單鏈。 3.具有高度特異性，只與靶核酸序列雜交，不與樣本中存在的其它核酸雜交。 4.探針長度一般是十幾個堿基不等，小片段探針較大片段探針雜交速率快。 5.作為探針的核苷酸序列要選取基因編碼序列，避免用內(nèi)含子及其它非編碼序列。 6.標(biāo)記的探針應(yīng)具有高靈敏度、穩(wěn)定，標(biāo)記方法簡便、安全。,71,(一）探針的分類,72,1、 Genomic probe,從基因組文庫中篩選和純化獲得的一個特定基因（或基因片段）的克

22、隆片段。多為某一基因的全部或部分序列（含有內(nèi)含子序列），或某一非編碼序列，或某一外顯子序列。,73,這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。 DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法，PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。,特點(diǎn)：,74,cDNA（complementary DNA）是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。 這種DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測。,2、 cDNA probe,75,采用基因克隆或體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得。有些病毒的基因組是R

23、NA，分離后經(jīng)適當(dāng)標(biāo)記可制成RNA探針。,3、 RNA probe,76,RNA探針優(yōu)勢,雜交的效率高，雜交體較穩(wěn)定。,RNA中不存在高度重復(fù)序列，因此非特異性雜交較少。,雜交后RNase將未雜交的探針分子消化掉，使本底降低。,77,寡核苷酸探針是采用DNA合成儀人工合成的，與已知基因DNA互補(bǔ)的，長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。一般長度為 2050 個堿基。 亦可根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列推導(dǎo)出核酸順序加以人工合成。,4、oligonucleotide probe,78,探針的制備方法,探針長度一般以50300bp為宜。 制備方法： 1）利用DNA重組技術(shù)（基因組DNA探針制備） 2）PCR擴(kuò)增

24、（cDNA探針制備） 3）化學(xué)合成（寡核苷酸探針制備）,79,制備基因組文庫,存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱為基因組DNA文庫（genomic DNA library) 。,制備探針時，增殖細(xì)菌，擴(kuò)增、提取質(zhì)粒，用限制酶切，回收特定基因片段，經(jīng)標(biāo)記則成為基因組DNA探針。,80,Construction of a Human Genomic Library,81,Restriction Enzyme - Action of EcoRI,82,DNA recombination,83,cDNA 探針制備,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,分離純化mRNA,PCR擴(kuò)增,84,根據(jù)已

25、知的核酸順序，采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段或根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列推導(dǎo)出核酸順序加以人工合成。,化學(xué)合成（寡核苷酸探針制備）,Genetic code,85,合成寡核苷酸探針注意原則：,1）長度（18-50 bp); 2）G:C對含量40%-60%； 3）探針內(nèi)避免互補(bǔ)； 4）避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)； 5）與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個以上堿基序列相同，最好不用。,Home,86,三、核酸探針的標(biāo)記,為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號。,87,（一）標(biāo)記物 1、理想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性：,1）標(biāo)記前后探針的基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性

26、質(zhì)相同; 2）特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好； 3）操作簡單、節(jié)時； 4）安全、無環(huán)境污染。,88,放射性核素,非放射性標(biāo)記,主要有：32P、35S、3H、125I、131I等。 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度和特異性極高，可檢出樣 品中少于1000個分子的核酸量。 缺點(diǎn)：半衰期短，穩(wěn)定性差，污染環(huán) 境、檢測需時較長。,主要有：生物素、地高辛、辣根過氧 化物酶，堿性磷酸酶及FITC等。 優(yōu)點(diǎn)： 具有穩(wěn)定、安全、經(jīng)濟(jì)及實(shí)驗(yàn)周期短等特點(diǎn)，近年來應(yīng)用越來越廣泛。 缺點(diǎn)：靈敏度低于放射性核素標(biāo)記的探針,2、標(biāo)記的種類,89,（二）探針的標(biāo)記方法,放射性同位素標(biāo)記法 缺口平移法(Nick translation) 隨機(jī)引物延

27、伸法(Random primer labelling) 末端標(biāo)記法(End labelling) 非放射性同位素標(biāo)記法 酶促標(biāo)記法、化學(xué)標(biāo)記法,90,缺口平移法的原理,將DNAase I 的水解活性與大腸桿菌DNA polymerase I 的53聚合酶活性和5 3外切酶活性相結(jié)合。 DNAase I 在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNA pol I的53外切酶活性，切去帶有5-磷酸的核苷酸；同時利用該酶53聚合酶活性，使生物素或同位素標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口。 這兩種活性同時作用，缺口不斷向3方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標(biāo)記的核苷酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA，純

28、化除去游離脫氧核苷酸后成為標(biāo)記DNA探針。,91,切口移位（平移）法,92,93,94,隨機(jī)引物標(biāo)記法原理,用一些六核苷酸作為隨機(jī)引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補(bǔ)配對原則不斷在其3- OH端添加標(biāo)記的單核苷酸修補(bǔ)缺口，合成新的標(biāo)記的探針片段。,95,96,97,末端標(biāo)記法原理,（1）一種是在5末端加成標(biāo)記法： 先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP轉(zhuǎn)移加到DNA片段5-OH上。 （2）在探針3-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個單標(biāo)記的ddUTP。,98,末端標(biāo)記法,99,10

29、0,非放射性同位素標(biāo)記法,光敏生物素標(biāo)記核酸,由一個光敏基團(tuán)、一個連接臂和一個生物素基團(tuán)組成。光生物素的光敏基團(tuán)是-N3，它在光作用下可與核酸中的堿基結(jié)合。,酶促標(biāo)記法,將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，利用酶促聚合反應(yīng)將其摻入到待標(biāo)記的探針分子中去，或?qū)⒑塑账岱肿由系臉?biāo)記基團(tuán)交換到核酸分子上。,101,探針的純化 1、乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白質(zhì) 2、凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是Sephadex G-50 3、微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同

30、的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針,102,103,核酸分子雜交信號的檢測,放射性同位素標(biāo)記探針： 放射自顯影。 非放射性同位素標(biāo)記探針： 偶聯(lián)反應(yīng)+顯色反應(yīng)。,104,放射自顯影,通過X光片檢測放射性核素標(biāo)記物。 其基本原理為：同位素在不斷衰變過程中釋放出-粒子，粒子撞擊X光片感光層，形成潛在影象，經(jīng)過顯影即可見到成像。,105,1偶聯(lián)反應(yīng) 可以通過抗原-抗體免疫反應(yīng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)。地高辛系類固醇半抗原化合物，地高辛標(biāo)記探針雜交信號可通過酶聯(lián)免疫法與抗地高辛抗體和堿性磷酸酶的復(fù)合物結(jié)合，再進(jìn)行酶促顯色反應(yīng)。,2顯色反應(yīng) （1）酶促顯色法：最常用的酶是堿性磷

31、酸酶和辣根過氧化物酶 （2）熒光法：熒光素探針主要用于原位雜交，最常用的為FITC。 （3）化學(xué)發(fā)光法：化學(xué)發(fā)光指在化學(xué)反應(yīng)過程中伴隨的發(fā)光反 應(yīng)。,化學(xué)法檢測,106,107,地高辛標(biāo)記探針雜交信號檢測,Home,108,四、核酸分子雜交技術(shù),固相雜交：結(jié)合于某種固相支持物上的待測樣品與溶解于雜交液中的探針進(jìn)行的雜交。包括膜上印跡雜交、原位雜交。 液相雜交：待測樣品和探針均溶于液體中進(jìn)行雜交反應(yīng)。,109,菌落雜交 (Colony in situ hybridization),常用的固相雜交類型,Southern印跡雜交 (Southern blotting),原位雜交 (in situ h

32、ybridization),其他類型雜交 （Other hybridization),110,核酸分子雜交的基本程序,111,此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計。被檢測對象為DNA。,（一）Southern 印跡雜交,112,Paper Towels,Southern Blotting,tissue,SDS,蛋白酶K,酚/氯仿,無水乙醇 離心,113,帶有DNA片段的凝膠,Southern 印跡雜交的技術(shù)流程,114,1、待測核酸樣品的制備 、裂解或破碎細(xì)胞 、抽取純化基因組DNA 、限制酶消化DNA為大小不同的 DNA片段,115,2、待測DNA樣品的電泳分離 、瓊脂糖濃度：分離大

33、片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠 、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動慢,小分子DNA泳動 快，大小 相同的分子處于同一 條帶 、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)Hind消化的DNA，雜 交所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素 標(biāo)記,116,3、凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈 DNA，中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。,4、Southern印跡 指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程。,117,固相支持物的選擇 （1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機(jī)械性能 非特異

34、吸附少,118,（2）常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號本 底低。缺點(diǎn)是DNA分子依靠疏水作用而吸附在膜上，結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號本底高 化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價結(jié)合；對不同大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能力較低,119,120,121,122,123,Southern印跡的常用方法,利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動，

35、同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上。,（1）毛細(xì)管虹吸印跡法,124,白瓷盤,玻璃板,濾紙,凝膠,尼龍膜,濾紙,吸水紙,玻璃板,重物,吸水紙轉(zhuǎn)膜,125,126,（2）真空轉(zhuǎn)移法,此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。,127,真空轉(zhuǎn)膜,128,129,（3）電轉(zhuǎn)法,利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。,130,131,5、Southern雜交 、預(yù)雜交：封閉膜上能與

36、DNA結(jié)合的位點(diǎn) 預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液。 、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA 雜交，雙鏈DNA探針需加熱變性為單 鏈，再雜交。 、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合 的 DNA。,132,6、雜交結(jié)果檢測 1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針 2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標(biāo)記的探針,133,7、Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突變分析 4、限制性片段長度多態(tài)性的分析,134,（二）Northern印跡雜交,1、基本原理和基本過程與Southern blot基 本相同 2、檢測目的RNA的存在與否及含量

37、3、探針可用DNA或RNA片段 4、待測樣品為總RNA或mRNA,這是經(jīng)典的RNA分析法，目前主要用于檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。,135,Northern印跡與Southern 印跡的不同點(diǎn) 1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理，Southern 印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理 3、靶核酸為RNA,136,28S,18S,RNA電泳,137,138,-1，4糖基轉(zhuǎn)移酶在損傷坐骨神經(jīng)中的表達(dá),139,Northern

38、雜交的主要用途,主要用于檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。,140,（三）Western印跡雜交,檢測蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗血清對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法。,141,主要步驟： 蛋白質(zhì)樣品的制備 PAGE電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：PVDF膜 靶蛋白的免疫學(xué)檢測 靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng) 與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng) 顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng),142,143,144,（四）斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交,Dot blotting and slot blotting,原理：是將被檢標(biāo)本的RNA或DNA變性

39、后直接點(diǎn)樣吸附于硝酸纖維膜上，然后用標(biāo)記探針與之雜交。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。 優(yōu)點(diǎn)：用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量分析，方法簡便、快速、靈敏、樣品用量少。 缺點(diǎn)：不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。,145,146,147,(五）原位雜交in situ hybridization,又分為菌落雜交或噬菌斑、以及真核細(xì)胞原位雜交。,它是利用標(biāo)記的已知核酸探針，在組織、細(xì)胞及染色體上檢測特異的DNA或RNA序列的核酸雜交技術(shù)。組織細(xì)胞原位雜交是檢測細(xì)胞內(nèi)的核酸片段，它保持了細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和組織的立體構(gòu)型，適合于核酸定位和分布研究。,148,核酸原位雜交的基本步驟,149,HPV,FISH,150,菌落原位雜交,菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。,151,152,153,液相雜交 指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜