1、生化實驗技術(shù),主講：錢國英 教授 浙江萬里學(xué)院,第一講 核酸化學(xué)實驗技術(shù) 第二講 蛋白質(zhì)化學(xué)實驗技術(shù) 第三講 酶學(xué)實驗技術(shù) 第四講 糖類化學(xué)實驗技術(shù) 第五講 脂類化學(xué)實驗技術(shù) 第六講 維生素和輔酶化學(xué)實驗技術(shù),實驗授課內(nèi)容,課堂理論：課前輔導(dǎo)生化大分子基本性質(zhì)、提取、分 離純化、含量檢測等相關(guān)生化物質(zhì)的分離分析技術(shù)。 項目任務(wù)：設(shè)計案例，引導(dǎo)學(xué)生去解決案例問題的方式 向?qū)W生布置項目任務(wù)、實驗設(shè)計和實施要求。 實驗設(shè)計：學(xué)生分組查閱資料設(shè)計實驗方案 網(wǎng)上遞交教師修改及審核大組討論評價 實驗操作：各小組（2人）為單位進(jìn)行實驗試劑、器材的 準(zhǔn)備，按實驗設(shè)計完成實驗內(nèi)容操作。 實驗論文：根據(jù)任務(wù)要求，

2、每位學(xué)生獨(dú)立完成課程論文。 課堂討論：大組為單位進(jìn)行全班ppt形式交流匯報,實驗實施流程,第一講 核酸化學(xué)實驗技術(shù),案例1,目前，人們的生活中充斥了越來越多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，如轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因玉米、馬鈴薯、水稻等等。 轉(zhuǎn)基因作為一種新興的生物技術(shù)手段，它的不成熟和不確定性，使得轉(zhuǎn)基因食品的安全性成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。,問題：如何檢測轉(zhuǎn)基因食品？,第一節(jié) 實驗項目發(fā)布與設(shè)計方案評價,什么是轉(zhuǎn)基因食品？,轉(zhuǎn)基因食品：以轉(zhuǎn)基因生物為直接食品或為原料加工生產(chǎn)的食品。 轉(zhuǎn)基因食品利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其他物種中去，改造生物的遺傳物質(zhì)，使其在形狀、營養(yǎng)品質(zhì)、消費(fèi)品質(zhì)等方面向人

3、們所需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變。,轉(zhuǎn)基因育種的程序？,標(biāo)記基因 啟動子 外源目的基因 終止序列,載體的構(gòu)建,轉(zhuǎn)基因食品的核酸檢測技術(shù),檢測對象：轉(zhuǎn)基因的啟動子、終止子、抗性篩選基因、目的基因等外源基因 檢測方法：普通定性PCR、實時熒光定量PCR、基因芯片 其中以普通定性PCR、實時熒光定量PCR最常用。,核酸定性PCR法檢測轉(zhuǎn)基因食品,樣品基因組DNA的提取 DNA提取質(zhì)量檢測 特有序列的PCR 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物 進(jìn)一步驗證：測序、PCR產(chǎn)物酶切鑒定、實時熒光定量PCR方法等,一般步驟,核酸定性PCR法檢測轉(zhuǎn)基因食品,案例2,某實驗人員從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)植酸酶的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化

4、特性初步鑒定為真菌。 真菌種類繁多，地球上大約存在150萬種真菌，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用的大約有69000種。,生物遺傳物質(zhì)攜帶了物種的特異信息，在屬種間具有高度的保守性。因此，可應(yīng)用分子生物學(xué)鑒定手段對真菌進(jìn)行種類鑒定和系統(tǒng)分類。,問題：如何準(zhǔn)確鑒定其種屬 ？,圖1 真菌rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)和相關(guān)引物,真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA 4種，在染色體上頭尾相連，串聯(lián)排列，相互間由間隔區(qū)分隔。 18S、5.8S和28S rDNA基因組成一個轉(zhuǎn)錄單元（圖1），三者高度保守，適合較高等級水平生物群體間的系統(tǒng)分析。 其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Tra

5、nscribed Spacer，ITS），包括ITS1和ITS2，進(jìn)化相對迅速，具有多態(tài)性，適合較低等級水平的系統(tǒng)學(xué)研究。,設(shè)計特定引物對該真菌菌株中的基因組中的rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)的特定核苷酸片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，與已知真菌序列比對即可確定該菌株在系統(tǒng)分類學(xué)上的位置。,基于rDNA-ITS序列在真菌分子鑒定中的應(yīng)用，你如何獲得高質(zhì)量的基因組DNA并鑒定菌株的目的基因序列？,表1 真菌rDNA-ITS通用擴(kuò)增引物,圖1 真菌rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)和相關(guān)引物,真菌rDNA-ITS通用引物,實驗設(shè)計要求： 根據(jù)案例提交一個具體解決基因組提取及分離鑒定的實驗設(shè)計方案，包括從提供

6、的不同材料中提取、分離得到基因組DNA，測定所得DNA的含量、純度及分子大小，并利用已知引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析PCR檢測的結(jié)果。,實驗題目： 基因組DNA的提取與PCR鑒定,實驗項目與任務(wù)布置,分組題目,項目1：定性PCR法檢測轉(zhuǎn)基因食品 項目2：rDNA-ITS擴(kuò)增法鑒定真菌種類,全班分成4大組，各選一個題目。 每個大組3個小組，2名同學(xué)一個小組。 以大組為單位進(jìn)行實驗準(zhǔn)備和討論。 以小組為單位進(jìn)行實驗設(shè)計和操作。,實驗?zāi)繕?biāo),學(xué)習(xí)從各種材料（動物、植物組織、微生物）中提取和純化DNA的原理和操作技術(shù)。 學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳及紫外檢測，確定DNA的純度、含量與分子大小。 學(xué)習(xí)PCR的基本

7、原理和操作方法。 掌握高速冷凍離心機(jī)、微量移液槍、水平電泳儀、PCR儀等儀器設(shè)備的使用。,實驗設(shè)計需包含的主要技術(shù)內(nèi)容,基因組DNA提?。嚎蛇x用濃鹽法、陰離子去污劑法、苯酚抽提法、水抽提法、試劑盒法等 DNA含量測定：可選用二苯胺法、紫外分光光度法等 DNA純度測定：紫外分光光度法 DNA分子大小測定：瓊脂糖凝膠電泳 PCR技術(shù),實驗結(jié)果要求,各標(biāo)準(zhǔn)曲線 基因組DNA產(chǎn)品得率（mg/100g) 基因組DNA產(chǎn)品純度 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖 PCR產(chǎn)物分子大?。╞p） 檢測結(jié)論,基因組DNA提取 4學(xué)時 DNA的含量與純度測定 4學(xué)時 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 4

8、學(xué)時 PCR及產(chǎn)物檢測 4學(xué)時,實驗時間安排,課后研討題,1.DNA提取的方法主要有哪些？并說明各方法的原理。 2.結(jié)合本人實驗操作的體會，試述在提取過程中應(yīng)如何避免大分子DNA的降解和斷裂？ 3.查閱資料，說明提取的基因組DNA有哪些方面的用途？ 4.查閱資料，舉例說明DNA瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用和發(fā)展。 5.瓊脂糖凝膠電泳所用DNA染料EB具有潛在的致癌性，查閱資料，查找可替代EB的染料并說明優(yōu)缺點(diǎn)。,課后研討題,6.結(jié)合本次實驗，說明PCR技術(shù)的主要用途和發(fā)展。 7.通過本次實驗，談?wù)勀銓D(zhuǎn)基因食品安全性的認(rèn)識。 8.查閱資料，說明轉(zhuǎn)基因食品檢測的常規(guī)方法。 9.查閱資料，綜述常用的物種分

9、子鑒定技術(shù)。 10.案例分析：在美國海豹突擊隊擊斃本拉登幾個小時后，美國總統(tǒng)奧巴馬向全世界宣布拉登已被成功擊斃，死者確定為本拉登的可能性是99.9%。查閱資料，根據(jù)所學(xué)核酸分子鑒定技術(shù)，分析如何對其進(jìn)行法醫(yī)鑒定。,相關(guān)事項,實驗習(xí)慣 藥品配制與保存 實驗記錄 實驗交流 實驗論文,Good Luck！,小組上交材料,論文格式模板,研討課要求,以大組為單位課后總結(jié)結(jié)果，討論，制作一份ppt，課內(nèi)討論匯報。 ppt內(nèi)容包括：實驗背景和目的，實驗主要原理，實驗條件的選擇，各小組實驗結(jié)果和分析，課后研討題，實驗體會等。,基因組是指細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的攜帶者DNA的總體。 為了研究DNA分子在生命代謝中的作用

10、，常常需要從不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當(dāng)?shù)牟牧咸崛NA。 從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。真核生物的DNA主要存在于細(xì)胞核中，與蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成染色體，原核生物的DNA不與任何蛋白質(zhì)結(jié)合。,理論介紹,一、內(nèi)容提要,保持基因組DNA結(jié)構(gòu)相對完整：防止各種因素引起的降解。 純度高：盡量排除其他大分子成分的污染（蛋白質(zhì)、多糖和RNA等）。 得率好：選用合適的方法獲得足夠量的DNA。,二、分離純化核酸的總原則,三、基因組DNA提取的原理和方法,裂解細(xì)胞，釋放DNA,核酸分離純化,沉淀并吸附核酸,核酸溶解（緩沖液）,準(zhǔn)備適宜的

11、材料,去除蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì),細(xì)胞破碎,細(xì)菌溶菌酶（降解細(xì)胞壁），EDTA（抑制DNA酶，防止DNA降解），去垢劑SDS（破壞細(xì)胞膜） 酵母破壁酶或液氮研磨 植物材料液氮研磨（使細(xì)胞凍結(jié)，用研缽碾制成粉狀） 動物組織勻漿或液氮研磨,化學(xué)法、機(jī)械法、生物法,DNA與蛋白質(zhì)的分離,SDS：真核生物的DNA與組蛋白結(jié)合形成DNP，SDS能夠破壞DNA與蛋白質(zhì)之間的靜電引力或配位鍵，可使DNA與蛋白質(zhì)解聚，釋放出DNA。 CTAB：是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液（NaCl0.7M）中是可溶的，當(dāng)NaCl降低到0.3M 時，可沉淀CTAB-核酸復(fù)合物。 苯酚-氯仿-異

12、戊醇：苯酚、氯仿能變性蛋白質(zhì)，離心分層，DNA溶于上層水相，變性蛋白質(zhì)位于水相和有機(jī)相之間。異戊醇可減少抽提過程的泡沫產(chǎn)生。,1.DNP中DNA與蛋白質(zhì)的分離,2.蛋白質(zhì)的去除,核酸分離純化,RNA的去除,用不含DNA酶的RNase處理，使RNA降解。 添加RNase處理后，可再用等量的苯酚/氯仿抽提，離心除去蛋白質(zhì)及寡核苷酸。,核酸分離純化,含DNA的水相可用1倍體積的異丙醇或2倍體積的無水乙醇沉淀。 基因組的大分子DNA沉淀形成纖維狀絮團(tuán)漂浮其中，可用吸頭將其挑出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附在壁上及底部。 如果DNA沉淀量少或無法撈出，可離心獲取沉淀。 沉淀DNA前，為提高沉淀效果

13、，可加入NaAC、乙酸銨等鹽類促進(jìn)沉淀。 獲取的沉淀需再用70%乙醇洗滌除去殘留的有機(jī)物、無機(jī)鹽等。,沉淀并吸附核酸,基因組DNA提取注意事項,使用新鮮、幼嫩的材料；材料應(yīng)適量，過少造成核酸提取量少，過多影響裂解，導(dǎo)致DNA量少。（推薦0.2-5g）。 簡化操作步驟，縮短提取過程，避免物理、化學(xué)和生物的因素對核酸的降解，如機(jī)械剪切力、高溫和DNase等酶，防止過酸、過堿，避免劇烈振蕩和混合。 采用酚-氯仿抽提時應(yīng)采用上下顛倒的方法充分混勻，但動作要輕柔，離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間。 沉淀DNA用的異戊醇、乙醇事先放入-20冰箱，待用時取出。,特別注意,液氮研磨時為防止凍傷，需戴棉線

14、手套操作，研磨越細(xì)越好。 苯酚腐蝕性極強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時應(yīng)戴手套。 一定要搞清提取原理，知道每一步操作DNA所在的位置，防止出錯。,四、基因組DNA的檢測,1、二苯胺顯色法測定DNA濃度 二苯胺法定量測定DNA的原理為：在強(qiáng)酸、加熱條件下，可以使DNA中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生嘌呤堿基、脫氧核糖與嘧啶核苷酸。其中，2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中成為w-羥基-r-酮基戊醛，此物與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在595nm處有最大吸收。DNA在40-400ug范圍內(nèi)光吸收值與DNA含量成正比。,詳見教材：實驗二十二 二苯胺顯色法測定DNA濃度,2、紫外分光光度法測定DNA含量 核酸

15、、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵，具有紫外吸收。DNA的紫外吸收峰為260nm。一般在260nm波長下，在pH7.0時每毫升含1g DNA溶液的光吸收值約為0.020。故測定待測DNA溶液260nm的光吸收值即可計算出其中核酸的含量。此法操作簡便，迅速。,詳見實驗課件：核酸定量測定,3、紫外分光光度法測定DNA純度 當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時，會影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測定。DNA純度的判斷根據(jù)OD260/OD280值判斷，符合要求、純度高的純化DNA其比值為1.8。如果樣品中污染有蛋白質(zhì)或酚，其OD260/OD280將明顯低于此值。此時無法對樣品中的核酸進(jìn)行精確定量。,4

16、、瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA分子大小 電泳是荷電溶質(zhì)或粒子在電場作用下發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。核酸的分離和鑒定通常采用瓊脂糖凝膠電泳。 不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA 分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。瓊脂糖凝膠電泳分離后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色。,詳見實驗課件：DNA的瓊脂糖凝膠電泳,五、PCR檢測技術(shù),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR），是一種選擇性的體外擴(kuò)增DNA或RNA的分子生物學(xué)技術(shù)。 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。,PCR由變性、退火、延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：,模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪