1、 上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司呼吸道病毒7項(xiàng)檢測(cè) 試劑2011-1-10呼吸道病毒7項(xiàng)檢測(cè)試劑目錄1概述12D3 Ultra DFA試劑22.1 D3 Ultra DFA試劑規(guī)格22.2 D3 Ultra DFA試劑用途22.3 D3 Ultra DFA試劑特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)22.4 D3 Ultra DFA試劑實(shí)驗(yàn)操作步驟32.5 D3 Ultra DFA試劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀43D3 Ultra DFA試劑競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)53.1 檢驗(yàn)的特異性和靈敏度53.2 市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)5附錄1 七種病毒檢測(cè)的臨床意義7附錄2 實(shí)驗(yàn)室所需設(shè)備清單（試劑盒中不含）8附錄3 進(jìn)口熒光顯微鏡參數(shù)9 上海復(fù)星

2、醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司1概述日常生活中，幾種常見(jiàn)的呼吸道病毒往往給人們的工作和生活帶來(lái)極大的不便，有些甚至威脅到人們的健康和生命。在醫(yī)院和急診室中，這些呼吸道病毒也常常是診斷和治療的難題。常見(jiàn)的呼吸道病毒包括：A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），腺病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型和副流感病毒3型。在病毒檢測(cè)方法中，抗原檢測(cè)有其無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)：1. 可以用于病毒的早期診斷，這對(duì)治療非常重要；2. 快速、簡(jiǎn)便的診斷方法，短時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果，節(jié)省實(shí)驗(yàn)室的勞動(dòng)力和成本。DHI公司的D3 Ultra DFA試劑屬于抗原檢測(cè)中的直接免疫熒光法。該試劑可以同時(shí)篩查和鑒定出常

3、見(jiàn)的7種呼吸道病毒。D3 Ultra DFA試劑主要的測(cè)試對(duì)象為嬰幼兒和兒童，所以目標(biāo)客戶(hù)群體為：兒童醫(yī)院、婦幼保健院和有兒科的三甲醫(yī)院。2D3 Ultra DFA試劑2.1 D3 Ultra DFA試劑規(guī)格D3 Ultra DFA試劑分為7項(xiàng)呼吸道病毒篩查試劑和7項(xiàng)呼吸道病毒鑒定試劑。檢測(cè)病毒種類(lèi)：A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），腺病毒，1、2、3型副流感病毒。具體規(guī)格如下：篩查試劑：10 mL，可用于400次測(cè)試鑒定試劑：每項(xiàng)鑒定試劑2 mL X 7，可用于80次測(cè)試另外，每盒試劑中含有40x濃縮洗液25 mL，固定液15 mL，正常鼠丙種球蛋白試劑1

4、0 mL（用于陰性質(zhì)控），含有7種呼吸道病毒抗原的陽(yáng)性質(zhì)控板5塊。2.2 D3 Ultra DFA試劑用途D3 Ultra DFA試劑能對(duì)疑似呼吸道病毒感染的患者進(jìn)行快速的病毒篩查和鑒定。及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷對(duì)于病人的治療非常重要，這主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：1、病毒治療針對(duì)性強(qiáng)金剛烷乙胺、瑞樂(lè)沙、奧司他韋（達(dá)菲）等是抗流感病毒的特效藥。RSV和副流感病毒可以使用利巴韋林和免疫球蛋白進(jìn)行治療。目前沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的抗腺病毒藥物，主要采取支持療法。2、病毒治療有時(shí)效性大部分呼吸道病毒越早治療效果越好。比如，奧司他韋在體內(nèi)的活性形式是一種強(qiáng)效的高選擇性的流感病毒NA抑制劑，它主要通過(guò)干擾病毒從被感染的宿主細(xì)胞中釋放

5、，從而減少甲型或乙型流感病毒的傳播。因此，在出現(xiàn)流感癥狀的48小時(shí)內(nèi)使用奧司他韋才有用，過(guò)了這個(gè)時(shí)間段后療效甚微。3、避免抗生素的濫用病毒不同于細(xì)菌、衣原體、支原體等原核生物，其對(duì)抗生素不敏感，不能使用抗生素進(jìn)行治療。準(zhǔn)確的診斷能幫助醫(yī)生確定是否使用抗生素來(lái)治療病人。2.3 D3 Ultra DFA試劑特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)1、產(chǎn)品幾乎覆蓋了所有常見(jiàn)呼吸道病毒的診斷2、采用直接免疫熒光法，較其他檢測(cè)方法有較大優(yōu)勢(shì)（詳見(jiàn)表一）3、實(shí)驗(yàn)步驟較簡(jiǎn)便，在短時(shí)間內(nèi)能得出結(jié)果，從而幫助醫(yī)生更好地治療病人4、使用質(zhì)量?jī)?yōu)異的抗體，染色步驟僅需15分鐘，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)室的勞動(dòng)力和成本，同時(shí)提高了臨床診斷的成功率，減少重復(fù)實(shí)

6、驗(yàn)5、可以監(jiān)控感染的大規(guī)模流行6、擁有強(qiáng)大的科研團(tuán)隊(duì)，不斷研制和改進(jìn)單克隆抗體表1、幾種常用檢測(cè)方法的比較檢測(cè)方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)病毒分離培養(yǎng)特異性高耗時(shí)耗力，靈敏度較低抗原檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附法較快速、簡(jiǎn)便有非特異性反應(yīng)間接免疫熒光法較快速有非特異性反應(yīng)直接免疫熒光法（D3 Ultra DFA試劑）快速、簡(jiǎn)便，靈敏度和特異性均較高需要使用熒光顯微鏡血清學(xué)檢測(cè)快速、特異性較高對(duì)疾病初期診斷沒(méi)有太大幫助分子生物學(xué)方法較快速，靈敏度和特異性均較高操作繁瑣，價(jià)格昂貴2.4 D3 Ultra DFA試劑實(shí)驗(yàn)操作步驟1、樣品準(zhǔn)備步驟：將樣本充分震蕩混勻約10-15秒。在400-600xg轉(zhuǎn)速下離心5-10分鐘。棄上

7、清（如果預(yù)留上清可用于細(xì)胞培養(yǎng)）。在沉淀中加5 mL PBS緩沖液（請(qǐng)使用普通PBS，不要使用試劑盒內(nèi)配套的濃縮洗液），充分震蕩混勻約10-15秒。在400-600xg轉(zhuǎn)速下離心5-10分鐘。吸走上清和黏液層，小心不要吸到沉淀。重復(fù)步驟4到6，直至黏液層被完全去除。注意：一定要將黏液去除干凈，否則會(huì)造成非特異熒光從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在沉淀中加0.5到1 mL的PBS緩沖液。用移液器反復(fù)吹吸來(lái)重懸細(xì)胞沉淀，形成一個(gè)略混濁的懸液。這個(gè)懸濁液可用于直接樣本測(cè)試。2、直接樣本測(cè)試步驟：在2孔或8孔板上的每孔內(nèi)滴加25 L的細(xì)胞懸濁液。樣本完全風(fēng)干。在20C到25C，用預(yù)冷的100%丙酮固定細(xì)胞約5到10

8、分鐘。注意：丙酮是易揮發(fā)、可燃性物質(zhì)，使用時(shí)請(qǐng)遠(yuǎn)離明火。從丙酮中取出載玻片并風(fēng)干。在固定并風(fēng)干的細(xì)胞上滴加一滴DFA染色試劑（如圖1），使其完全覆蓋細(xì)胞（注意：2孔或8孔板上有一孔是陰性對(duì)照孔，請(qǐng)勿滴加DFA染色試劑）。在呼吸道病毒抗原對(duì)照板的每孔內(nèi)也要滴加DFA染色試劑?？乖瓕?duì)照板包含了被病毒感染的細(xì)胞和未感染的細(xì)胞，只能一次性使用。在陰性對(duì)照孔內(nèi)滴加正常鼠丙種球蛋白試劑，使其完全覆蓋細(xì)胞。將載玻片放于35C到37C的恒溫箱內(nèi)孵育15到30分鐘，為保持其濕潤(rùn)最好放置于帶蓋的盒子內(nèi)。用事先稀釋好的洗液漂洗染色細(xì)胞。為了更有效地洗滌，請(qǐng)將玻片在洗液中反復(fù)浸蘸4次左右。使用新的1X洗液再洗一次。用

9、去離子水再洗一遍。圖1、在玻璃板上滴加D3 Ultra DFA染色試劑3、觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果滴加2到3滴固定液，并加蓋蓋玻片（20X50 mm），要注意避免產(chǎn)生氣泡。在200倍放大熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。2.5 D3 Ultra DFA試劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀帶FITC標(biāo)記的抗體在熒光顯微鏡下會(huì)呈現(xiàn)明亮的綠色，如果細(xì)胞表面存在病毒抗原，染色后就會(huì)顯綠色。在熒光顯微鏡下，感染不同病毒的細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)獨(dú)有的特征（如圖2）。圖2、顯微鏡下觀察染色細(xì)胞（注：根據(jù)不同熒光顯微鏡，背景色不一定為紅色）3D3 Ultra DFA試劑競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)3.1 檢驗(yàn)的特異性和靈敏度檢驗(yàn)的特異性: 用D3 Ultra DFA 呼吸道病毒篩查和

10、鑒定試劑對(duì)多種細(xì)胞和微生物進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試。對(duì)64種病毒、18種細(xì)胞、19種細(xì)菌均沒(méi)有交叉反應(yīng)。檢驗(yàn)的靈敏度：熒光標(biāo)記的單克隆抗體平均能檢測(cè)出病毒的最低濃度約為1.0 PFU。3.2 市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)主要競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手為西班牙Vircell公司的9項(xiàng)呼吸道產(chǎn)品。D3 Ultra DFA試劑與其主要有兩點(diǎn)不同：1. 檢測(cè)項(xiàng)目不同；2. 檢測(cè)原理不同1、Vircell產(chǎn)品檢測(cè)項(xiàng)目除了以上7種病毒外，還包含肺炎衣原體、支原體等原核生物檢測(cè)項(xiàng)目。但是，90%的感冒是由病毒引起的。如果是細(xì)菌、衣原體、支原體等感染，一般白細(xì)胞和C-反應(yīng)蛋白（CRP）都會(huì)顯著升高，而病毒感染，這兩項(xiàng)指標(biāo)一般不會(huì)升高。我們建議醫(yī)生可以先做

11、血常規(guī)或者CRP檢測(cè)，這樣就能區(qū)分是病毒還是細(xì)菌感染，而這兩項(xiàng)測(cè)試不僅快速（一般20-30分鐘），而且價(jià)格相對(duì)便宜。2、D3 Ultra DFA試劑的檢測(cè)原理是用熒光（FITC）標(biāo)記的單克隆抗體檢測(cè)病毒抗原，屬于直接熒光免疫法。Vircell產(chǎn)品的檢測(cè)原理是用抗原檢測(cè)抗體（IgM），使用的方法是間接免疫熒光法。雖然檢測(cè)IgM能區(qū)分出是既往感染還是急性感染，但是抗體產(chǎn)生的個(gè)體差異較大，特別是1歲以下的嬰幼兒和有免疫缺陷的人群，其抗體往往產(chǎn)生較慢。短時(shí)間內(nèi)，在體內(nèi)抗體不足的情況下，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性，從而錯(cuò)過(guò)了治療的最佳時(shí)期。甲型流感病毒其表面抗原變異較快，而人體往往不能及時(shí)產(chǎn)生針對(duì)新毒株的抗體，這

12、時(shí)也會(huì)造成假陰性。間接免疫熒光法會(huì)增加非特異性反應(yīng)的幾率。表2、Vircell與D3 Ultra DFA試劑對(duì)比VircellD3 Ultra DFA檢測(cè)項(xiàng)目9項(xiàng)呼吸道病原體，其中包含在我國(guó)發(fā)病率很低的Q熱立克次氏體只檢測(cè)呼吸道病毒，降低患者的看病成本，患者更易接受檢測(cè)原理需要體內(nèi)產(chǎn)生抗體后才能檢測(cè)出病原體，如果抗體產(chǎn)生較慢或者無(wú)抗體產(chǎn)生會(huì)有假陰性只要有病原體存在即可檢測(cè)，可在發(fā)病早期進(jìn)行快速診斷臨床意義*作為回顧性診斷，對(duì)病例的早期診斷意義不大可用于疾病早期診斷，對(duì)患者的治療有重大意義檢測(cè)靈敏度不能很好地檢測(cè)變異的病毒將多種抗體進(jìn)行組合，能更好地應(yīng)對(duì)變異的病毒，在多項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目中靈敏度達(dá)到10

13、0%檢測(cè)方法間接免疫熒光法，二抗的使用會(huì)增加非特異性反應(yīng)直接免疫熒光法，特異性提高實(shí)驗(yàn)步驟二抗的使用讓實(shí)驗(yàn)步驟變得較為繁瑣一步染色，不易交叉污染*備注：引用自流行性感冒診斷與治療指南（2011年版）附錄1 七種病毒檢測(cè)的臨床意義流感病毒侵入呼吸道，經(jīng)1-2天的潛伏期，感染者即可出現(xiàn)流感癥狀。病毒在上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，很少入血，但可釋放內(nèi)毒素樣物質(zhì)入血，引起全身中毒癥狀：發(fā)熱、頭痛、全身酸痛、疲乏無(wú)力、白細(xì)胞數(shù)下降等。幼兒或年老體弱病人感染流感病毒易繼發(fā)細(xì)菌感染，如合并肺炎等，病死率高。嬰幼兒特別是2-6個(gè)月的嬰兒對(duì)RSV特別敏感，常引起較為嚴(yán)重的呼吸道疾病，如細(xì)支氣管炎、肺炎等，患兒常出現(xiàn)呼吸暫停

14、，氣管或細(xì)支氣管壞死物與粘液、纖維蛋白等結(jié)集在一起，極易阻塞患兒的呼吸道，嚴(yán)重者造成死亡。在我國(guó)RSV還是引發(fā)流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起嬰幼兒尤其是新生兒較高的死率。腺病毒主要引起呼吸道感染，癥狀有急性發(fā)燒、咽炎、扁桃體炎等。腺病毒肺炎約占兒童期肺炎的10%，多由腺病毒3、7型引起；嬰幼兒腺病毒肺炎的病死率為8%-10%。除呼吸道疾病外，腺病毒亦可引起其他疾病，如流行性角膜炎、出血性結(jié)膜炎、急性濾泡性結(jié)膜炎等。腺病毒與嬰幼兒胃腸道疾病也有可能相關(guān)，包括闌尾炎、急性胃腸炎，有時(shí)可引起腦炎和腦膜炎、出血性膀胱炎等。副流感病毒是引起小兒急性呼吸道感染的常見(jiàn)病因，僅次于RSV。副流感1、2型是

15、哮喘的主要病因，以2-4歲兒童中最為嚴(yán)重。副流感3型，亦可引起哮喘，但主要易引起嬰幼兒支氣管炎、肺炎，并以1歲以?xún)?nèi)的嬰兒較為嚴(yán)重。病毒及其對(duì)應(yīng)抗病毒藥病毒種類(lèi)抗病毒藥物流感病毒金剛烷乙胺、瑞樂(lè)沙、奧司他韋（達(dá)菲）呼吸道合胞病毒利巴韋林噴霧劑副流感病毒病情嚴(yán)重者可使用利巴韋林腺病毒沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的抗病毒藥物，主要采取支持療法附錄2 實(shí)驗(yàn)室所需設(shè)備清單（試劑盒中不含）此列表中的器材和試劑是實(shí)驗(yàn)所必需的，但是未包含在試劑盒中，需要單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)。器材和試劑規(guī)格1鼻咽拭子建議使用DHI配套鼻咽拭子2載玻片約70 mm X 20 mm 3蓋玻片約50 mm X 20 mm4生物安全柜2級(jí)5恒溫培養(yǎng)箱35C-37C6離心機(jī)管式7熒光顯微鏡可以看FITC（490/520 nm），總200倍光學(xué)變焦8燒杯多種，用于洗玻片9量筒1 L（配置洗液）10帶蓋瓶1 L（儲(chǔ)存稀釋洗液）11加樣槍和槍頭多種12丙酮純度100%13普通PBS溶液0.01 M (Na2HP