1、第七章 病毒變異,重點(diǎn): 1.病毒變異的幾種現(xiàn)象？ 2.導(dǎo)致干擾現(xiàn)象的原因 3.病毒突變的類型、定義及區(qū)別 難點(diǎn): 1.DI顆粒的特征; 2. 錯(cuò)義突變 、表型混合; 3.分子內(nèi)重組與重配,一.論述,遺傳與變異是生物界不斷發(fā)生的普遍現(xiàn)象，也是物種形成和生物進(jìn)化的基礎(chǔ)，微生物遺傳學(xué)作為一門獨(dú)立的學(xué)科，誕生于40年代，病毒遺傳學(xué)作為微生物遺傳學(xué)的重要組成部分，對(duì)于生物遺傳和變異的研究起到了重要促進(jìn)作用，也為分子遺傳學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，病毒的許多生物學(xué)特性，包括結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無性增殖方式，可經(jīng)C培養(yǎng),增殖迅速，便于純化等，使其具有作為遺傳學(xué)研究材料的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。,大多數(shù)病毒具有明顯的遺傳穩(wěn)定性，但由于病毒

2、不具有細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，其遺傳變異易受周圍環(huán)境的影響。特別是病毒以基因形式在細(xì)胞內(nèi)繁殖，在繁殖過程中，病毒的核酸更易受細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響而發(fā)生改變，這就決定了病毒的遺傳具有較大的變異性。,二變異現(xiàn)象,首先講一下幾種變異現(xiàn)象 ： 1.毒力變異：“毒力”表示毒株或毒型間病原性的差異（如NDV按毒力分為強(qiáng)毒型，中毒型，弱毒型），具體表現(xiàn)為所能感染動(dòng)物，組織和C范圍及其引起的癥狀、死亡率和病變的程度不同。 例如由感染動(dòng)物，媒介昆蟲或污染物等分離的病毒株，毒力常常不同（因而可從不同養(yǎng)殖場(chǎng)分離不同毒株做自家疫苗，例IBD分離）。某些自然分離株的毒力很弱，經(jīng)過選育，?？捎米饕呙缍局辍?2. 抗原變異： 病毒抗原性差

3、別的表現(xiàn)。通常所謂的病毒“型”，實(shí)質(zhì)上是病毒抗原性差別的表現(xiàn)，它們主要是用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)，沉淀反應(yīng)，凝集反應(yīng)以及中和試驗(yàn)等血清學(xué)方法鑒別出來的，那些具有許多“型”的病毒，大都也是易于變異的病毒，流感V和口蹄疫V是其中最顯著的例子。,AIV：許多型;由16個(gè)血凝素H和9個(gè)N氨酸酶組合而成，98年香港流行H5N1,我國99-2015流行H5N2、H9、H7，可用其瓊擴(kuò)HA，HI?？谔阋遃：分七個(gè)型：O、A、C,SAT1(南非I型)SAT2,SAT3,和亞洲I型,不同型無交叉免疫性。,如流感病毒的變異，具體表現(xiàn)為表面抗原，它存在兩種變化形式：抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)移,抗原漂移-是指病毒在自然宿主內(nèi)頻繁傳代后

4、，所出現(xiàn)的抗原性微小變化。一般認(rèn)為這是在免疫反應(yīng)的壓力下，突變體選擇的結(jié)果。 抗原轉(zhuǎn)移-是指病毒抗原性突發(fā)的巨大變化。一般推測(cè)這是基因重組的結(jié)果；也有認(rèn)為這是由于量變的積累而導(dǎo)致質(zhì)變的發(fā)生 。,流感病毒的抗原變異,3培養(yǎng)特性變異: V的所謂培養(yǎng)性狀，主要指其在培養(yǎng)C上形成的蝕斑的形態(tài)和性質(zhì)，實(shí)際上是V所引起的細(xì)胞病變的特征。各種V在組織培養(yǎng)C上產(chǎn)生的蝕斑性狀，隨V和C的種類不同而有一定差異（即使相似也有差異）。,而培養(yǎng)條件，例培養(yǎng)液和瓊脂的成分和濃度，PH，二氧化碳張力以及培養(yǎng)的T和時(shí)間，甚至培養(yǎng)容器的種類等，也對(duì)蝕斑的產(chǎn)生和性狀呈現(xiàn)明顯影響,動(dòng)物血清和瓊脂（特別是瓊脂中的硫酸多糖）對(duì)病毒的蝕

5、斑形成具有比較明顯的抑制作用.,(1)蝕斑的大小： 決定于病毒的彌散和吸附率以及病毒在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)、成熟、釋放的速度及其在細(xì)胞內(nèi)外的死亡率等但亦隨培養(yǎng)條件和時(shí)間而不同。,(2)蝕斑的色澤： 蝕斑的透明度和色澤取決于蝕斑及其周緣的細(xì)胞的死亡與溶崩情況，蝕斑中細(xì)胞完全溶崩時(shí)，蝕斑透明無色；而其中殘留較多死亡和病變細(xì)胞時(shí)，蝕斑渾濁或呈白色。而其中存留較多活細(xì)胞時(shí)，蝕斑可因著染中性紅而呈紅色。 (3)蝕斑的形狀： 蝕斑形狀的規(guī)則與否，邊緣是否清晰取決于病毒的彌散率及細(xì)胞的病變率。,4對(duì)溫度感受性的變異,是指在較低溫度下繁殖，但在較高溫度下不能繁殖，而相應(yīng)的野生型在這兩種溫度都能繁殖的突變體。,5. 對(duì)化

6、學(xué)藥物的感受性變異 將鹽酸胍、羥苯丙咪唑或鹽酸金剛烷胺等病毒的滅活劑或誘變劑添加于已經(jīng)接種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)過多次反復(fù)傳代之后，可以獲得對(duì)這些化學(xué)藥物有抗性、甚至有依賴性病毒新變種。常因編碼病毒酶基因的改變而降低了靶酶對(duì)藥物的親和力或作用，從而使病毒對(duì)藥物不敏感而能繼續(xù)增殖。 這種現(xiàn)象隨著病毒化學(xué)治療藥物的增多，耐藥現(xiàn)象可能將成為病毒化學(xué)治療中一個(gè)需要充分注意和解決的問題,6. 營(yíng)養(yǎng)變異 是指病毒對(duì)某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)反應(yīng)的變異。如一種病毒必須胱氨酸的存在才能形成蝕斑，當(dāng)采用培養(yǎng)液中不含胱氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)這種病毒時(shí)，可以選育得到不需胱氨酸甚至可被胱氨酸抑制的變異株。,一、突變的概念 病毒的突變（Mut

7、ation）是指基因組中核酸堿基順序上的化學(xué)變化，可以是一個(gè)核苷酸的改變，也可為上百上千個(gè)核苷酸的缺失或易位。,突變 （Mutation）,二、病毒突變分類 一般分為自發(fā)突變和誘導(dǎo)突變。 （1）自發(fā)突變：是在沒有任何已知誘變劑的條件下，病毒子代產(chǎn)生高比例的突變體，最后導(dǎo)致表型變異；病毒復(fù)制中的自然突變率10-5-10-8。DNA病毒和RNA病毒在突變頻率上有較大的差別。,（2）誘導(dǎo)突變：是利用不同的物理或化學(xué)誘變劑（如溫度、射線、5-溴尿嘧啶、亞硝酸鹽等）處理病毒，提高病毒群體突變率，誘導(dǎo)病毒子代出現(xiàn)特定的突變類型。,三、突變的機(jī)理 從機(jī)理上，突變有兩種主要類型，即位點(diǎn)突變，缺失突變。,一）位

8、點(diǎn)突變 (Point mutation） 病毒的基因組通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，后者轉(zhuǎn)譯成結(jié)構(gòu)多肽或功能多肽。如果基因組的核苷酸堿基發(fā)生了改變，即會(huì)對(duì)多肽的特性產(chǎn)生影響。 3個(gè)堿基組構(gòu)成一個(gè)遺傳密碼。一般地講第3堿基發(fā)生了突變有時(shí)影響不大，如GGA，GGC，GGU，GGG，四個(gè)密碼轉(zhuǎn)譯的氨基酸均為甘氨酸，此稱無表型突變，假如密碼中第一或第二個(gè)堿基發(fā)生改變，則轉(zhuǎn)譯的氨基酸就會(huì)發(fā)生改變,如：GGA（甘氨酸）變成GCA（丙氨酸）和AGA（精氨酸）等。,錯(cuò)義突變 ：某個(gè)氨基酸改變有時(shí)不影響pro構(gòu)型和穩(wěn)定性，在此情況下，基因組的表型仍維持原狀，如果改變的氨基酸處于結(jié)構(gòu)上的重要位置，那么多肽的正常功能就會(huì)喪

9、失。如GGA（甘氨酸）AGA（精氨酸）前者的側(cè)鏈?zhǔn)侵行缘?，而后者的?cè)鏈?zhǔn)菈A性的。GGAGAA（谷氨酸），后者側(cè)鏈?zhǔn)撬嵝缘?，這一轉(zhuǎn)變導(dǎo)致多肽的構(gòu)型發(fā)生嚴(yán)重影響，因而它的活性大為改變，如果是酶，則喪失了催化功能。,位點(diǎn)突變的特點(diǎn),在單一核酸的堿基中發(fā)生了改變。 多數(shù)的點(diǎn)突變株為條件致死性突變株， 它只能在某些條件下增殖，但不能在另外一些條件下增殖 如：溫度敏感突變株( temperature-sensitive mutation) ： 也稱為ts突變株，其最高生長(zhǎng)溫度比正常病毒低。28-35可以復(fù)制， 37-40不能復(fù)制。如:脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗。,ts 突變株常具有減低毒力而保持其免疫原性的特點(diǎn)

10、，是生產(chǎn)疫苗的理想毒株。但ts 突變株容易回復(fù),因此制備疫苗時(shí)須經(jīng)多次誘變后，方可獲得在一定宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定傳代的突變株，亦稱變異株（variant）。脊髓灰質(zhì)炎病毒活疫苗即為這種變異株。 位點(diǎn)突變引起的變種是多種多樣的，還如空斑大 小的變種，酶缺陷變種;,二.缺失突變,這種突變中，病毒基因組的一部分被丟失，如果這部分核酸序列是無關(guān)緊要的，則病毒的表型不會(huì)受到明顯影響，如果是關(guān)鍵部分，則病毒將失去獨(dú)立繁殖的能力，甚至是致死性 。如缺陷性干擾顆粒(defective interfering paticle，DIP)。,某些條件下，如C培養(yǎng)中，接種大量病毒并連續(xù)傳代，易感C被感染后只產(chǎn)生少量有感染性

11、的病毒粒子，而大量病毒粒子的基因組不完全,這種情況極普遍，幾乎所有RNA病毒和大量DNA病毒各科都有發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)同源的完全病毒有干擾作用。,DI顆粒的特征如下：,1.病毒接種量大（MOI高），并以此連續(xù)傳代，DI顆粒逐增，而完整病毒逐減。 2.DI顆粒的產(chǎn)生也受宿主細(xì)胞種類控制。例NDV在CEF上傳代時(shí)DI顆粒不斷增多，而在雞胚中則不易產(chǎn)生。,3. DI顆?；蚪M不全，用核酸指紋圖分析，核苷酸序列有各種各樣的缺失。 4. DI顆粒形態(tài)與完全（整）病毒沒有兩樣，沉降系數(shù)也變化不大，因此常污染于完全病毒制劑中，而不被察覺。,5. DI顆粒必須在完全病毒存在條件下，才繁殖，因它不能生產(chǎn)必須的全部功能

12、pro及結(jié)構(gòu)pro。 6. DI顆粒干擾同源病毒完整粒子的生成機(jī)理尚未完全闡明，一般認(rèn)為核酸鏈較短，因此復(fù)制的時(shí)間較快。 7. DI顆粒與病毒的持續(xù)性感染有密切關(guān)系，對(duì)動(dòng)物體來說，DI顆粒可減輕發(fā)病，減少死亡，更有可能引起慢性帶毒感染。,三 插入突變,在病毒基因組中插入一段核苷酸序列。,四 抑制性突變,突變的核苷酸有可能發(fā)生回復(fù)突變。也可能因?yàn)橄嗤踔敛煌虬l(fā)生抑制性突變(suppresser mutation)，使突變逆轉(zhuǎn)，重新具有與起始毒株相同的表型。如流感病毒往往由于毫不相關(guān)的基因自行發(fā)生抑制性突變，使之失去作為弱毒疫苗的價(jià)值。,$2病毒間互相作用,一.遺傳重組 指兩種不同病毒間或同一

13、種病毒的兩個(gè)不同毒株間發(fā)生核酸交換，子代核酸序列來自兩個(gè)親代，這種現(xiàn)象一般發(fā)生于分類上很接近的兩種病毒。遺傳重組有兩種情況： 1.分子內(nèi)重組：是兩種不同、通常是密切相關(guān)的兩種病毒的核酸序列的交換，DNA病毒可發(fā)生，RNA病毒也較普遍。,例如： 西部馬腦脊髓炎病毒就是： 類仙臺(tái)病毒 東部馬腦脊髓炎病毒 不同科的病毒也可發(fā)生分子內(nèi)重組。 如乳多空病毒和腺病毒 病毒與宿主細(xì)胞之間也可發(fā)生分子內(nèi)重組。,2.重配：主要發(fā)現(xiàn)于節(jié)段病毒，當(dāng)兩種相近病毒同時(shí)感染一個(gè)細(xì)胞時(shí)，它們的基因組中有一個(gè)或幾個(gè)節(jié)段發(fā)生交換。 如：人類的流感每隔十年左右引起一次世界性大流行，可能是由于人的流感病毒與某些動(dòng)物（雞、馬、豬）的

14、流感病毒間發(fā)生基因重配所致。,重組recombination,重組,重配reassortment,3、復(fù) 活,交叉復(fù)活：有傳染性的病毒與滅活的相關(guān)病毒或該病毒的DNA片段共同培養(yǎng)，產(chǎn)生具有滅活病毒特性的活病毒。 2)多重復(fù)活：例如用紫外線滅活的兩株同種病毒,若一同培養(yǎng)后，?？墒箿缁畹牟《緩?fù)活，產(chǎn)生出感染性病毒體。 這是因?yàn)閮煞N病毒核酸上受損害的基因部位不同，由于重組合相互彌補(bǔ)而得到復(fù)活。因此現(xiàn)今不用紫外線滅活病毒制造疫苗，以防病毒復(fù)活的危險(xiǎn)。,二.表型混合,具有某些共同特征的兩種病毒在混合感染時(shí)，有些子代的表型具有雙方親代特征，而基因型卻無變化，這種現(xiàn)象稱為表型混合。,例流感病毒和NDV等混合

15、感染同一細(xì)胞時(shí)，有些子代的囊膜抗原具有兩種親代病毒特征，囊膜病毒所顯示的表型混合，可能是一個(gè)病毒的基因組偶爾裝入另一病毒的衣殼內(nèi)，或裝入兩個(gè)病毒成分構(gòu)成的衣殼內(nèi)，發(fā)生表型混合。這種混合是不穩(wěn)定的，傳代后可恢復(fù)其原來的特性 ； 缺陷性的羅氏肉瘤病毒的囊膜來自輔助病毒，這種里外不一致的病毒稱為假型。,無囊膜的20面體病毒中也常發(fā)現(xiàn)表型混合，例如口蹄疫病毒與一種抗原性無關(guān)的牛腸道病毒混合感染，這種現(xiàn)象稱為基因組掩蔽或衣殼交換 。 主要表現(xiàn)為耐藥性，抗原性等改變，大多基因并未改變，改變的生物學(xué)性狀不能遺傳。,表型混合示意圖,表型混合,三.互補(bǔ) 通常發(fā)生在兩種病毒混合感染時(shí)，由于一種病毒為另一種病毒提供

16、其必需的但又不能自己合成的基因產(chǎn)物，而促進(jìn)了增殖；或者兩種病毒互為對(duì)方提供必需的基因產(chǎn)物，使雙方的增殖均有所促進(jìn)。,根據(jù)參與病毒的情況，分以下幾類: (1)輔助病毒與缺損病毒的互補(bǔ) (2)有活力病毒與滅活病毒互補(bǔ) (3)兩株條件致死突變體間的互補(bǔ) (4)病毒內(nèi)互補(bǔ)。,四.病毒間的非遺傳相互作用,1干擾現(xiàn)象：發(fā)生于不同病毒間，也發(fā)現(xiàn)在同種病毒的不同毒株間，甚至發(fā)現(xiàn)在同種的滅活病毒與活毒之間。干擾機(jī)理可能不是單一的，下列原因都可導(dǎo)致干擾 ： (1) 細(xì)胞膜上的病毒受體被第一種病毒所破壞，因此第二種病毒不能吸附，這種現(xiàn)象一般發(fā)現(xiàn)在同種病毒之間。,(2) 第一種病毒封鎖了第二種病毒mRNA的轉(zhuǎn)譯，或第

17、一種病毒的核酸復(fù)制酶使第二種病毒的基因組喪失功能。 (3)DI顆粒（第一節(jié)） (4)干擾素：這是由病毒感染的宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的一種抑制病毒的可溶性糖蛋白。,2. 增強(qiáng)作用：在某些混合感染中，一種病毒可以增強(qiáng)第二種病毒的生長(zhǎng)，這種反應(yīng)不但見于兩種互不相關(guān)的病毒間，也偶見于同種病毒的兩個(gè)變異株之間。 在獸醫(yī)中，牛瘟病毒可以增強(qiáng)牛丘疹性口炎病毒，豬瘟病毒在豬睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)中能增強(qiáng)NDV生長(zhǎng)，此稱END試驗(yàn)（豬腎原代細(xì)胞中培養(yǎng)的HEIC試驗(yàn)即血凝增加病變抑制試驗(yàn)），已被用于診斷NDV。有些DNA病毒能增強(qiáng)RNA病毒的生長(zhǎng)。,3.互不干擾：兩種不同的病毒如侵入同一個(gè)宿主細(xì)胞，可以各自獨(dú)立地繁殖，各自產(chǎn)生特征性感染。,$3 缺陷V,第一節(jié)我們講了DI顆粒是因缺失突變引起不完全病毒顆粒,而自然界中存在一些天生的缺陷病毒，它們?cè)谌魏螚l件下都不能獨(dú)立繁殖，必須依靠另一種病毒提供某些必需物質(zhì)，因此后者稱為輔助病毒，前者稱衛(wèi)星病毒，它們之間具天然協(xié)助關(guān)系。例如DNA病毒中細(xì)小病毒科的依賴病毒屬，只有在腺病毒存在條件下才