1、李清華 公共衛(wèi)生學(xué)院,1,第二節(jié) 發(fā)酵基本工藝與發(fā)酵設(shè)備,主要內(nèi)容 一、發(fā)酵工藝流程 二、常見發(fā)酵設(shè)備 1、發(fā)酵罐的設(shè)計原則 2、微生物細胞反應(yīng)器 3、動物細胞培養(yǎng)反應(yīng) 4、植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器,2,從自然界分離的菌種,4,一、發(fā)酵工藝流程,典型的發(fā)酵生產(chǎn)過程包括： 菌種的選育 確定菌種繁殖和發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基； 對培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備進行滅菌； 菌種經(jīng)逐級擴大培養(yǎng)后，作為生產(chǎn)種子接種于發(fā)酵罐中 ; 控制發(fā)酵罐中微生物的生長條件，最大程度地獲得人們渴望的代謝產(chǎn)物 ; 產(chǎn)物萃取和精制 ; 發(fā)酵過程中廢棄物的處理與回收.,菌種的選育,要想通過發(fā)酵工程獲得在種類、產(chǎn)量和質(zhì)量等方面符合人們要求的

2、產(chǎn)品，最重要的是要有優(yōu)良的菌種。,對菌種一般有以下要求： 菌種能在較短的發(fā)酵過程中高產(chǎn)有價值的發(fā)酵產(chǎn)品。 菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)價廉，來源充足，被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的效率高。如農(nóng)副產(chǎn)品。 菌種對人、動物、植物和環(huán)境不應(yīng)該造成危害，還應(yīng)注意潛在的、慢性的、長期的危害，要嚴格防護。 菌種發(fā)酵后，所產(chǎn)不需要的代謝產(chǎn)物少，且產(chǎn)品相對容易地與不需要的物質(zhì)分離，下游技術(shù)能用于規(guī)模化生產(chǎn)。 菌種的遺傳特性穩(wěn)定，而且易于進行基因操作。,培養(yǎng)基的配制,進行發(fā)酵生產(chǎn)，有了優(yōu)良的菌種還需要有與菌種相適應(yīng)的培養(yǎng)基。在配制培養(yǎng)基時應(yīng)該注意： （1）根據(jù)不同的菌種，應(yīng)選擇不同的材料配制培養(yǎng)基。配制的培養(yǎng)基應(yīng)滿足微生物在碳源、氮源、生

3、長因子、水、無機鹽等方面的營養(yǎng)要求，并為微生物提供適宜的pH、滲透壓等。 （2）培養(yǎng)基的營養(yǎng)要協(xié)調(diào)，以利于產(chǎn)物的合成。 （3）培養(yǎng)基在滿足微生物的營養(yǎng)需求的基礎(chǔ)上應(yīng)盡量降低生產(chǎn)成本，以得到更高的經(jīng)濟效益。,滅菌,發(fā)酵工程所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程中不能混入雜菌。 在發(fā)酵過程中如混入其他微生物，將與菌種形成競爭關(guān)系，對發(fā)酵過程造成不良影響。 例如：在谷氨酸發(fā)酵過程中混入放線菌，則放線菌分泌的抗生素就會使大量的谷氨酸棒狀桿菌死亡；在青霉素生產(chǎn)過程中污染了雜菌，這些雜菌則會分泌青霉素酶，將合成的青霉素分解掉。,滅菌,那如何防止雜菌的污染呢？ 要在發(fā)酵前對培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)施進行嚴格的滅菌處

4、理。 空消、實消 怎樣才算滅菌徹底呢？ 用高溫、高壓的方式，殺死所有雜菌的胞體、芽孢和孢子。,擴大培養(yǎng)和接種,如何得到發(fā)酵生產(chǎn)所需要的大量菌體來縮短生產(chǎn)周期？ 經(jīng)過多次的擴大培養(yǎng)。 如何對菌種進行擴大培養(yǎng)？ 擴大培養(yǎng)是將培養(yǎng)到對數(shù)期的菌體分開，分頭進行培養(yǎng)，以促使菌體數(shù)量快速增加，能在短時間里得到大量的菌體。,擴大培養(yǎng)和接種,擴大培養(yǎng)與發(fā)酵生產(chǎn)過程中的培養(yǎng)不同： 擴大培養(yǎng)是為了讓菌體在短時期內(nèi)快速增殖，而發(fā)酵過程中的培養(yǎng)是為了獲得代謝產(chǎn)物，目的不同采用的培養(yǎng)條件就有可能不同。 例如：在酒精發(fā)酵過程中，擴大培養(yǎng)是為了促使酵母菌快速增殖，因此是在有氧條件下進行。而在發(fā)酵產(chǎn)生酒精的過程中則必須在無氧

5、條件下進行以獲得大量的酒精。 有了用于生產(chǎn)的充足的菌體，接種過程中要注意防止雜菌污染。,發(fā)酵過程,為什么將菌體接種到裝有培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，還需要對發(fā)酵過程進行檢測和對發(fā)酵條件進行控制？ 發(fā)酵產(chǎn)物主要在菌體生長的穩(wěn)定期產(chǎn)生。因此，要在發(fā)酵過程中隨時取樣檢測培養(yǎng)液中細菌數(shù)目、產(chǎn)物濃度以了解發(fā)酵進程，及時添加必需的培養(yǎng)基成分來延長菌體生長穩(wěn)定期的時間，以得到更多的發(fā)酵產(chǎn)物。同時，還應(yīng)對發(fā)酵條件進行嚴格控制。,發(fā)酵過程,哪些條件能影響菌體的發(fā)酵？ 發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵罐內(nèi)部的代謝變化，如菌體形態(tài)、菌體濃度、營養(yǎng)物質(zhì)的濃度、溫度、pH、溶氧量、產(chǎn)物濃度、以及發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速等對發(fā)酵過程都有重大影響。,分離、提純

6、,代謝產(chǎn)物 采用離心、過濾、沉淀等方法將菌體從培養(yǎng)液中分離出來。 菌體本身，如酵母菌和細菌等 采用蒸餾、萃取、離子交換等方法進行提取。,二 、發(fā)酵設(shè)備,生物反應(yīng)器(發(fā)酵罐),利用生物工程技術(shù)進行生產(chǎn)的過程統(tǒng)稱生物反應(yīng)過程 。,采用活細胞(包括微生物、動植物細胞)的某些特定功能生產(chǎn)有用產(chǎn)品的生物反應(yīng)過程稱為發(fā)酵過程或細胞培養(yǎng)過程。 采用游離或固定化酶作為生物催化劑的生物反應(yīng)過程，稱為酶反應(yīng)過程。,生物反應(yīng)器：利用酶或生物體（如微生物）所具有的生物功能，在體外進行生化反應(yīng)的裝置系統(tǒng)。,生物反應(yīng)器應(yīng)具備的條件： 能維持一定的溫度、pH、反應(yīng)物(如營養(yǎng)物質(zhì)、溶解氧等)濃度； 應(yīng)具備良好的傳質(zhì)、傳熱和混

7、合性能，以便為生物反應(yīng)的順利進行提供適宜的環(huán)境條件； 細胞生物反應(yīng)器除具備上述特性外，還要求有一定的除菌及密封設(shè)備，以防止生產(chǎn)過程中因微生物侵入造成的雜菌污染。,根據(jù)生物反應(yīng)過程中所使用的生物催化劑不同可將生物反應(yīng)器分為： 酶反應(yīng)器和（微）細胞生物反應(yīng)器。,（一） 發(fā)酵罐設(shè)計的原則,發(fā)酵罐的主要功能： 為菌體生長，或為某一特定的微生物混合發(fā)酵劑提供一個便于控制的環(huán)境，以獲得人們所期望的產(chǎn)物 。,發(fā)酵罐設(shè)計的原則,1、發(fā)酵器應(yīng)能在無菌條件下工作數(shù)天，且應(yīng)在長時間運轉(zhuǎn)過程中保持穩(wěn)定； 2、通氣和充分攪拌，以滿足微生物代謝的需要，但不應(yīng)損傷菌體；,3、盡可能低的功率消耗； 4、發(fā)酵罐上應(yīng)配備有溫度和

8、pH值控制系統(tǒng)以及采樣裝置 ； 5、發(fā)酵罐內(nèi)的蒸發(fā)損失不應(yīng)太多； 6、在放料、清洗和維修等操作過程中具有最低的勞動力消耗；,7、發(fā)酵罐應(yīng)有較好的適應(yīng)性，以滿足不同生產(chǎn)廠家的需求； 8、發(fā)酵罐內(nèi)表面應(yīng)光滑； 9、用于中試規(guī)模的發(fā)酵罐與用于實際生產(chǎn)的發(fā)酵罐應(yīng)具有相同的幾何形狀，有利于放大生產(chǎn)； 10、使用既能滿足工藝要求又比較便宜的制造材料，同時應(yīng)配備完善的供給設(shè)施。,發(fā)酵罐（總結(jié)） 穩(wěn)定性 控制性 操作性 安全性 可視性,設(shè)計原則,（二）微生物細胞反應(yīng)器,依攪拌方式不同，微生物細胞反應(yīng)器有： 內(nèi)部機械攪拌型 外部液體攪拌型 氣升循環(huán)式發(fā)酵罐,微生物反應(yīng)器,1、機械攪拌型微生物細胞生物反應(yīng)器(通用

9、型),主要由殼體、控溫部分、攪拌部分、通氣部分、進出料口、測量系統(tǒng)和附屬系統(tǒng)等組成。,BIOTECH- X JS型機械攪拌不銹鋼發(fā)酵罐,殼體的作用：一般為不銹鋼材料，為整個發(fā)酵過程提供一個密封的環(huán)境，防止雜菌污染；同時為了能在一定壓力下進行高溫滅菌，要求罐體承受的壓力至少在0.3MPa以上。 控溫部分的作用：是保證發(fā)酵過程在恒溫條件下進行，并將生物氧化和機械攪拌產(chǎn)生的熱量及時移去。 攪拌部分的作用：使罐內(nèi)物料混合良好，液體中的固形物料保持懸浮狀態(tài)，有利于菌體與營養(yǎng)物質(zhì)充分接觸，便于營養(yǎng)吸收。另一方面，打碎氣泡，增加氣液接觸面積，提高氣液間的傳質(zhì)速率，加強氧的傳遞效果及消除泡沫。,通氣部分的作用

10、：是從罐的底部向罐內(nèi)通入無菌空氣，一般入口空氣壓力為0.10.2MPa(表壓)，罐頂部有空氣出口。 進出料口：是指進料和出料用的系統(tǒng)，同時還配有補料口裝置等 測量系統(tǒng)：在于測量發(fā)酵過程中的pH值、溶解氧等相關(guān)數(shù)據(jù)，以便對發(fā)酵過程進行隨時的監(jiān)測并及時對發(fā)酵參數(shù)進行調(diào)整。此外，測量裝置應(yīng)能承受一定的滅菌溫度并在長時間內(nèi)保持穩(wěn)定。,通用機械攪拌型生物反應(yīng)器內(nèi)通常安裝消泡裝置，抑制泡沫的形成，但泡沫過多時，要使用消泡劑。 附屬系統(tǒng)是指用以觀察發(fā)酵液情況的視鏡裝置和強化發(fā)酵液混合（防止液面中央產(chǎn)生旋渦，提高溶解氧）的擋板等設(shè)備。,2、機械攪拌自吸式反應(yīng)器,優(yōu)點： （1）可以利用攪拌器旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生的抽吸力吸

11、入空氣，不需要空氣壓縮機提供壓縮空氣，從而省去了空氣系統(tǒng)，使設(shè)備成本降低。 （2）其攪拌器是一個空心葉輪，葉輪快速旋轉(zhuǎn)時，液體由于離心作用而被甩出，并在葉輪空心部分形成負壓，從而將罐外的空氣吸到罐內(nèi)。同時，空氣因受到高速流動液體的摩擦剪切作用而變成細小的氣泡，均勻分散在液體之中，然后借助導(dǎo)輪流將氣液混合物導(dǎo)入發(fā)酵液中并與之混合。,缺點 （1）進罐空氣處于負壓狀態(tài)，容易增加雜菌侵入的機會。 （2）攪拌容易導(dǎo)致轉(zhuǎn)速提高，有可能使某些微生物的菌絲被切斷，影響細胞的正常生長。,3、氣升式環(huán)流反應(yīng)器,類型：內(nèi)環(huán)流式、外環(huán)流式,氣升式發(fā)酵罐不具有任何機械攪拌系統(tǒng)，僅利用空氣在發(fā)酵罐內(nèi)（外）循環(huán)以攪拌培養(yǎng)物

12、，這一相對柔和的混合系統(tǒng)適用于植物細胞和動物細胞培養(yǎng)。 原理基于含氣量高的培養(yǎng)物和含氣量少的培養(yǎng)物之間比重的差異。在發(fā)酵罐通氣過程中，含氣量較低的培養(yǎng)基產(chǎn)生一上流的推力，導(dǎo)致培養(yǎng)基的循環(huán)。 借助設(shè)在環(huán)流管底部的空氣噴嘴將空氣以250300m/s的高速噴入環(huán)流管，使氣泡分散在培養(yǎng)基中。,氣升式玻璃系列實驗室發(fā)酵罐,氣升式環(huán)流反應(yīng)器的優(yōu)點,（1）氣體從罐的下部通入，可帶動流體在整個反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)流動，使反應(yīng)器內(nèi)的溶液容易混合均勻； （2）由于不用機械攪拌槳，省去了密封裝置，使污染雜菌的機會減少，同時降低了機械剪切作用對細胞的傷害； （3）由于液體循環(huán)速度較快，反應(yīng)器內(nèi)的供氧及傳熱都較好，利于節(jié)約能源

13、。,氣升式環(huán)流反應(yīng)器不適宜于在黏度大或含有大量固體的培養(yǎng)液中應(yīng)用。,衡量氣升式環(huán)流反應(yīng)器性能的參數(shù)主要有：,循環(huán)周期 氣液比。 循環(huán)周期：指培養(yǎng)液在環(huán)流管內(nèi)循環(huán)一次所需的時間。 氣液比：指培養(yǎng)液的環(huán)流量與通風(fēng)量之比。 循環(huán)周期越短，氣液比值越大，說明向培養(yǎng)基內(nèi)供氧越充分。,4、高位塔式生物反應(yīng)器,是一種罐體的高與直徑比值較大，利用通入培養(yǎng)液的無菌空氣泡上升來帶動液體運動，產(chǎn)生混合效果的非機械攪拌式生物反應(yīng)器，適用于培養(yǎng)液黏度低、固體含量少和需氧量較低的發(fā)酵培養(yǎng)過程。,與機械攪拌式生物反應(yīng)器相比，塔式生物反應(yīng)器不設(shè)機械攪拌槳的優(yōu)點是：,（1）減少了剪切作用對細胞的損害； （2）結(jié)構(gòu)簡單，省去了密

14、封，排除了因密封不嚴而造成的雜菌污染； （3）造價較低，動力消耗少，操作成本低，噪聲較小。 缺點：這種反應(yīng)器罐體較高，需要在室外安裝，而且壓縮空氣必須有足夠大的壓力才能抵消反應(yīng)器內(nèi)液體的靜壓力。,（三）動物細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器,氣升式生物反應(yīng)器 中空纖維反應(yīng)器 籠式通氣攪拌反應(yīng)器 流化床反應(yīng)器,1、氣升式細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器,將氣體混合物從罐底部的噴射管噴入反應(yīng)器的中央導(dǎo)流管，使中央導(dǎo)流管內(nèi)的液體密度低于外部區(qū)域液體的密度，從而形成循環(huán)。 在氣升式生物反應(yīng)器中，可以通過自動調(diào)節(jié)空氣進入的速率來實現(xiàn)對溶解氧濃度的控制；pH值可通過在進氣中加入二氧化碳或加入氫氧化鈉的方法來控制。,BIOTECH-X

15、QS型氣升式發(fā)酵罐,2、中空纖維管生物反應(yīng)器,既可培養(yǎng)懸浮型的細胞，又可培養(yǎng)貼壁型細胞，培養(yǎng)的細胞密度甚至可達到109個/mL數(shù)量級，主要用于雜交瘤細胞的培養(yǎng)來生產(chǎn)單克隆抗體。,中空纖維管生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細胞和獲得的分泌產(chǎn)物,3、通氣攪拌生物反應(yīng)器,（1）Spier籠式通氣攪拌生物反應(yīng)器 優(yōu)點：可以避免通氣時氣泡直接損傷細胞。它是借助一個多孔的通氣裝置在籠內(nèi)通氣，滿足培養(yǎng)過程中細胞對溶解氧的需要。 缺點：是不能進行在線滅菌，只能將罐體放在消毒鍋內(nèi)進行高壓滅菌；氧傳遞系數(shù)小，不能滿足培養(yǎng)高密度細胞的耗氧要求；反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，拆卸清洗困難。,（2）CelliGen-20雙層籠式通氣攪拌生物反

16、應(yīng)器,優(yōu)點：擴大了絲網(wǎng)交換面積，使氧傳遞系數(shù)提高，單位面積產(chǎn)量增加，形成了由雙層籠式通氣攪拌器、控制系統(tǒng)、管路系統(tǒng)和蒸汽滅菌系統(tǒng)一體化的動物細胞培養(yǎng)裝置。 適于懸浮培養(yǎng)雜交瘤細胞來生產(chǎn)單克隆抗體、微載體培養(yǎng)Vero細胞和乙腦病毒。,4、流化床生物反應(yīng)器,特點：在反應(yīng)器內(nèi)，通過垂直向上循環(huán)流動，培養(yǎng)液不斷供給細胞必要的營養(yǎng)成分，使細胞得以在微粒中生長。同時，不斷地加入新鮮的培養(yǎng)液，并不斷地排除培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。 流化床生物反應(yīng)器可用于貼壁依賴型細胞的培養(yǎng)和非貼壁依賴型細胞的培養(yǎng)。,5、無泡沫攪拌生物反應(yīng)器,特點：能滿足動物細胞生長中所需的溶氧要求，產(chǎn)生的剪切力較小，在通氣過程中不產(chǎn)生泡沫。,（

17、四） 植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器,類型： 機械攪拌式生物反應(yīng)器 氣升式生物反應(yīng)器 填充床生物反應(yīng)器 流化床生物反應(yīng)器 膜式生物反應(yīng)器,1、機械攪拌生物反應(yīng)器,特點：機械攪拌會產(chǎn)生較大的剪切力，損傷細胞，同時容易引發(fā)雜菌污染，所以植物細胞培養(yǎng)中一般不用機械攪拌反應(yīng)器。,2、氣升式生物反應(yīng)器,特點：減少了剪切力的作用，避免了細胞損傷，而且在操作中容易保持無菌狀態(tài)，比較適宜于植物細胞培養(yǎng)。,3、填充床生物反應(yīng)器,特點：在填充床生物反應(yīng)器中，細胞可以位于支撐物表面，也可以包埋于支撐物之中。培養(yǎng)液流經(jīng)支撐物顆粒，不斷被細胞所利用。,優(yōu)點：單位體積固定細胞量大。 缺點：混合效果較差，給氧的傳遞、pH值控制、溫度控制以及氣體產(chǎn)物的排除帶來了困難，從而影響細胞的培養(yǎng),4、流化床生物反應(yīng)器,流化床生物反應(yīng)器的最大缺點是剪切力和顆粒的碰撞會損壞固定化細胞。,通常采用小固定化顆粒。,5、膜生物反應(yīng)器,膜反應(yīng)器的優(yōu)點是可以重復(fù)使用,57,一種植物細胞表面固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，避免了傳統(tǒng)攪拌罐懸浮培養(yǎng)中的