1、Chapter 2 蛋白質(zhì),Chapter 2 蛋白質(zhì),2.1 蛋白質(zhì)的概念、重要性及分類 2.2 氨基酸 2.3 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 2.4 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系 2.5 蛋白質(zhì)的性質(zhì) 2.6 蛋白質(zhì)的提取、分離和純化,2.6 蛋白質(zhì)的分離、純化,研究一個新的蛋白質(zhì)首先要從它的基本性質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本性質(zhì)進行分離純化，最終用純品對其進行分析鑒定。如果對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)尚未搞清楚，工作起來將會困難重重。 因此，蛋白質(zhì)研究技術(shù)主要是對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)進行的分析鑒定。,研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。 (1)蛋白質(zhì)來源：微生物細胞、動物細胞和植物細胞； (2)分

2、離和純化過程都必須04的低溫下進行。,蛋白質(zhì)的分離、純化,1蛋白質(zhì)的分離步驟,(1)生物組織的機械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。 (2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進行抽提。 水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提； 酸性蛋白用稀堿性溶液抽提； 脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。 (3)粗提: 離心除去固體雜質(zhì)后，可通過鹽析、沉淀法、凝膠濾法、超過濾等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。 (4)精制：可用層析法、電泳法等進行精制。 (5)成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。,2蛋白質(zhì)的純化方法,透析是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜，而使它與其它小分子化合物，如無機鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小

3、肽以及水等分離。 常用的半透膜是玻璃紙或稱賽璐玢紙、火棉紙和其它合成材料。膜有玻璃紙或高分子合成材料，截止分子量一般為1萬。,（1）透析法（dialysis),凝膠過濾原理 當不同大小的蛋白質(zhì)顆粒流經(jīng)凝膠柱時，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進入凝膠珠內(nèi)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下移動并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度地自由出入凝膠珠的內(nèi)外。,凝膠過濾層析,蛋白質(zhì)分子一般有兩種形狀，一種是球形分子，另一種是線性分子。線性蛋白質(zhì)分子與球形分子比較，同樣大小分子量的蛋白質(zhì)，線性分子體積大流速快，球形分子體積小流速慢。因此，在凝膠色譜柱中無論是球形分子還是線性分子都可進

4、行分離，但球形分子比線性分子的分離度好。,此法是利用離子交換劑作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進行分離的方法。 離子交換樹脂可以分為陽離子交換樹脂（如羧甲基纖維素等），陰離子交換樹脂（如二乙基氨基乙基纖維素等）。 帶正電荷多的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合較強，而帶正電荷少的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合則較弱。 用不同濃度的陽離子洗脫液，如NaCl溶液進行梯度洗脫，通過Na+的離子交換作用，或是改變流動相的PH值，或是同時采用這兩種方法，可以將帶有不同正電荷的蛋白質(zhì)進行分離。,離子交換層析,（2）柱層析,2蛋白質(zhì)的純化方法,離子交換層析,這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體上

5、的特殊配基具有不同的識別和結(jié)合能力。 選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識別和結(jié)合作用的配基，然后應用化學方法將該配基與載體共價連接。 將這種連接有配基的載體裝入層析柱中，當含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。 被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當?shù)呐潴w洗脫液或高鹽溶液洗脫。,親和層析,（2）柱層析,2蛋白質(zhì)的純化方法,+,C,C,C,配基,蛋白質(zhì),1.配基固相化,2.親和吸附,固體載體,3.解吸附,在外電場的作用下，帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。 帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動的速度（v）取決于電

6、場強度(E)，所帶的凈電荷(q)以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)(f)。 常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳等。,（3）電泳法,2蛋白質(zhì)的純化方法, SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，也稱為十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。主要用于蛋白質(zhì)亞基分子量的測定。,(1)原理： a.蛋白質(zhì)分子狀態(tài) 在自然狀態(tài)下蛋白質(zhì)通過二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質(zhì)分子形成帶有一定凈電荷的分

7、子。在電場下向自身電荷相反的方向移動。,b. 還原劑的解聚作用 在蛋白溶液和分離凝膠介質(zhì)中加入還原劑-巰基乙醇(- mercaptoethanol)或二硫蘇糖醇(Dithiothretiol, DTT)。蛋白質(zhì)分子在還原劑作用下二硫鍵被還原，將多聚體或單鏈折疊的蛋白質(zhì)分子的二硫鍵打開，形成長短不一的單鏈亞基。,c. SDS的包裹作用 SDS分子中含有大量的帶負電的磺酸基。蛋白質(zhì)分子解聚后形成的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合，在SDS的重量達到蛋白重量的3-4倍時蛋白質(zhì)分子表面完全被SDS包裹，形成帶負電荷的蛋白質(zhì)亞基分子，稱之為蛋白質(zhì)-SDS復合物( protein-SDS micelles)。 由于

8、蛋白質(zhì)-SDS復合物所帶負電荷遠大于蛋白質(zhì)分子自身有的凈電荷，這樣就消除了不同分子之間原有的電荷差異。,d. 聚丙烯酰胺凝膠分子篩作用 不同濃度的凝膠和交聯(lián)度，形成不同大小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它對蛋白質(zhì)-SDS復合物具有阻滯作用。在電場下，分子量大的亞基受阻大，電泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亞基受阻小，電泳速度快，走在大分子的前面。不同分子量的亞基受阻程度不同，表現(xiàn)出不同的電泳速度，這樣就把同一樣品中不同大小分子量的亞基分開。,(2) 操作過程 制膠 加樣 電泳 固定 染色 脫色 計算,(3) 結(jié)果處理 a. 電泳圖譜,1 2 3,b.標準曲線 繪制標準曲線：以標準蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)log(

9、M)為縱坐標，Rf值為橫坐標，繪制標準曲線。,c.未知蛋白分子量計算： 將未知蛋白的Rf值查到log(M)值，便可知其分子量。計算分子量。,(4) 影響因素 影響SDS-復合物形成的主要因素。SDS-電泳成敗關(guān)之一，是在制備樣品的過程中，蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的程度直接影響電泳分離效果。影響結(jié)合的因素主要有三個: A.溶液中SDS單體的濃度 SDS在水溶液中以單體和SDS復合物混合存在的，能與蛋白質(zhì)結(jié)合的只能是單體。單體的濃度與SDS總濃度，溫度和離子強度有關(guān)。在一定溫度和離子強度下，SDS處于一飽和值，即單體濃度不再隨SDS中濃度增加而增加。為了使SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合充分，SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合的重量

10、比一般是4:1或3:1。,B. 樣品緩沖液離子強度 因為SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量取決于平衡時SDS單體濃度，而不是總濃度，只有在較低的離子強度溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度，所以樣品緩沖液應選用低離子強度，通常是10-100mmol/l之間。 C. 二硫鍵是否完全打開 只有蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵完全被打開，蛋白質(zhì)分子完全解聚，SDS充分與亞基分子結(jié)合，才能準確測定出亞基分子量。二硫鍵完全被打開要取決于巰基乙醇的質(zhì)量和使用的劑量。若蛋白質(zhì)分子的二硫鍵只是部分被打開，這是測出的分子量是蛋白質(zhì)分子和亞基分子的混合物。, 等電聚焦電泳(isoelectric focusing, IEF ）

11、a. 原理: 通常是指聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳。它是60年代初建立起來的一種蛋白質(zhì)分離手段，現(xiàn)在已經(jīng)成為單向蛋白質(zhì)電泳分辨率最高的一種分離技術(shù)。 它是利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點的差異進行電泳分離和分析。蛋白質(zhì)在一個穩(wěn)定的線性pH梯度的凝膠中電泳，蛋白質(zhì)朝著與自身電荷相反的方向移動，在移動的過程中不斷被凝膠中的反離子中和，最后靜電荷完全被中和而停止運動，聚焦在等電點的位置。,b.蛋白質(zhì)與兩性電解質(zhì) (1)蛋白質(zhì)的等電點 蛋白質(zhì)屬于一種兩性電解質(zhì)。在不同的pH環(huán)境中所帶的正負電荷不同。若在某特定的pH環(huán)境中其凈電荷為零，此時的pH為該蛋白質(zhì)的等電點，在電場下不泳動。,(2)載體兩性電解

12、質(zhì)： 在等電聚焦電泳中，載體兩性電解質(zhì)具有以下兩種功能： A 中和功能： 兩性電解質(zhì)的性質(zhì)在分離系統(tǒng)中形成一個平衡穩(wěn)定的pH梯度，提供中和蛋白質(zhì)電荷的離子，具有pH緩沖能。 B 載電功能： 兩性電解質(zhì)作為電的載體，具有運載“電流”的能力，有良好的導電性能,水平板式電泳槽,垂直板式電泳槽,等電聚焦時，蛋白質(zhì)混合物的分離是在具有PH梯度的介質(zhì)中進行的。在電場中，每種蛋白質(zhì)成分將移向并“聚焦”（停留在等于其等電點的PH梯度處，形成一個很窄的區(qū)帶。它的分辨率很高，可以把人的血清分成40多個區(qū)帶。適于做同工酶的鑒定。,方法: 制膠 加樣 電泳 固定 染色 脫色 計算,等電聚焦, 雙向電泳（two-dimensional electrophoresis） 雙向電泳是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進行SDS-PAGE（按照分子大?。?，經(jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖。,肽的化學合成（了解）,