1、腫瘤免疫與CAR-T細胞治療,主要內(nèi)容,腫瘤免疫逃逸 腫瘤免疫治療 CAR-T細胞治療,腫瘤抗原,定義：細胞癌變過程中新出現(xiàn)的抗原,以及過度表達的抗原物質(zhì),的總稱,產(chǎn)生機制,新的蛋白質(zhì),蛋白的特殊降解產(chǎn)物,基因突變或重排使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,隱蔽的抗原表位暴露,多種膜蛋白分子的異常聚集,胚胎抗原或分化抗原的異常高表達,腫瘤特異性抗原：,腫瘤相關(guān)抗原：,（Tumor specific antigen , TSA),（Tumor associated antigen , TAA),腫瘤細胞特有，正常細胞不存在,正常細胞組織也存在，但腫瘤細胞中含量明顯增高,二. 機體抗腫瘤免疫機制,非特異性免疫：,特

2、異性免疫,巨噬細胞、NK細胞、多形核細胞,體液免疫 細胞免疫,(一）體液免疫機制,1. CDC、ADCC、調(diào)理作用：,通過補體、巨噬細胞、NK細胞、中性粒細胞 介導(dǎo)殺傷腫瘤細胞,2. 封閉抗體：,抑制： 與腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化、增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)的抗原,如 p185可抑制增殖、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體可抑制生長、粘附分子可阻止克隆形成與轉(zhuǎn)移,增強抗體：,封閉抗原位點，阻礙殺傷性免疫細胞的作用,（二）細胞免疫機制,1. T細胞,腫瘤Ag,腫瘤細胞的MHC I類分子遞呈,CD8+ CTL,脫落后由APC攝取、MHC II類分子遞呈,CD4+ Th,CD8+ CTL,直接殺傷,分泌多種細胞因子,IFN-、TNF,CD4

3、+ Th,釋放CK如IL-2：激活CTL、NK、巨噬細胞,釋放IFN-、TNF：促進MHC I類表達、 有利于直接殺傷,促進B細胞活化、增殖、分化,少數(shù)可直接殺傷腫瘤細胞,1. NK細胞,不依賴抗體或補體、不需預(yù)先活化、 無MHC限制即可直接殺傷腫瘤細胞,通過激活性受體/抑制性受體的平衡而識別,特異性免疫應(yīng)答的效應(yīng)階段（ADCC）,（三）非特異性免疫,2、 T細胞,3. 巨噬細胞,作為APC，激活T,巨噬細胞殺傷腫瘤,三. 腫瘤免疫逃逸機制,（一）與腫瘤有關(guān)的因素,1. 抗原缺失或抗原調(diào)變,遺傳不穩(wěn)定性,突變或丟失,免疫原性極弱,抗原調(diào)變( antigenic modulation ),免疫系

4、統(tǒng)攻擊導(dǎo)致腫瘤細胞表面抗 原表位減少或丟失，從而逃避殺傷,2. MHC I類分子表達減少,3. 缺乏協(xié)同刺激分子：B7、ICAM-1、LFA-1,4. 漏逸：腫瘤迅速生長超越機體清除能力,5. 腫瘤導(dǎo)致的免疫抑制：,分泌某些CK（如TGF-、IL-10）,營造局部免疫豁免（如高表達Fas L破壞免疫細胞）,（二）與宿主有關(guān)的因素,免疫功能低下或缺陷,免疫抑制,免疫耐受狀態(tài),腫瘤免疫治療（cancer immunotherapy）是利用人體的免疫機制，通過主動或被動的方法來增強患者免疫功能，達到殺傷腫瘤細胞的目的，為腫瘤生物治療方法之一。,腫瘤免疫治療的原理是通過增強抗腫瘤免疫應(yīng)答和打破腫瘤的免

5、疫抑制產(chǎn)生抗腫瘤作用。,腫瘤免疫治療分類,一、,主動免疫治療,二、,被動免疫治療,三、,非特異性免疫調(diào)節(jié)劑治療,一、主動免疫治療,也稱為腫瘤疫苗，主要是利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質(zhì)免疫機體，使宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對腫瘤抗原的抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而阻止腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。 腫瘤疫苗是對已患病者進行免疫接種，激發(fā)腫瘤患者機體產(chǎn)生對腫瘤的特異性免疫應(yīng)答。可產(chǎn)生免疫記憶，抗腫瘤作用比較持久。 分類 ：腫瘤細胞疫苗、腫瘤多肽（蛋白）疫苗、樹突狀細胞疫苗、抗獨特型抗體疫苗、DNA疫苗,1.腫瘤細胞疫苗 2.腫瘤多肽（蛋白）疫苗 3.DC疫苗 4.抗獨特型抗體疫苗 5.DNA疫苗,腫瘤全細胞疫苗,腫瘤細胞裂解物

6、疫苗,基因修飾的腫瘤細胞疫苗,3.DC疫苗,4.抗獨特型抗體疫苗,2.腫瘤多肽（蛋白）疫苗,5.DNA疫苗,腫瘤的主動免疫治療分類,1.腫瘤細胞疫苗,已批準(zhǔn)進行期臨床試驗及臨床應(yīng)用的腫瘤疫苗舉例,二、被動免疫治療,被動免疫治療（passive immunotherapy）又稱為過繼免疫治療（adoptive immunotherapy）是被動性的將具有抗腫瘤活性的免疫制劑或細胞轉(zhuǎn)輸給腫瘤患者，以達到治療腫瘤的目的。 被動免疫治療與腫瘤疫苗不同，并不需要機體產(chǎn)生初始免疫應(yīng)答，因此適用于已經(jīng)沒有時間或能力產(chǎn)生初始免疫應(yīng)答的腫瘤晚期患者。 分類：單克隆抗體治療;過繼性細胞治療,又稱之為生物導(dǎo)彈技術(shù)，

7、通過補體系統(tǒng)、自然殺傷細胞和阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起抗腫瘤作用。,嵌合型單抗達到95%以上人源化，減少了免疫原性。 利妥西單抗治療惡性淋巴瘤；曲妥珠單抗治療乳癌，聯(lián)合化療增強療效。,單克隆抗體治療,過繼性細胞治療,過繼性細胞治療是通過分離自體或異體免疫效應(yīng)細胞，經(jīng)體外激活并回輸，直接殺傷腫瘤或激發(fā)機體抗腫瘤免疫反應(yīng)。,過繼性細胞治療的關(guān)鍵在于產(chǎn)生數(shù)量足夠、能夠識別并殺傷腫瘤的免疫細胞，以及效應(yīng)細胞能夠到達腫瘤所在部位，并在腫瘤周圍被激活且發(fā)揮抗瘤作用。 淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）、自然殺傷細胞（NK）、細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（CIK）、腫瘤浸潤T淋巴細胞（TIL）、T細胞、自然殺傷T細胞（NK

8、 T）、CD3單抗激活的殺傷細胞（CD3AK）、供者淋巴細胞輸注（donor lymphocyte infusion，DLI）、受體基因修飾的T細胞等,淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）是外周血單個核細胞在體外經(jīng)IL-2刺激活化后誘生的具有非特異性細胞毒作用的效應(yīng)細胞，是多種免疫細胞的群體。 LAK細胞抗癌譜廣，抗腫瘤作用不依賴抗原致敏。LAK細胞通過直接接觸或釋放炎癥細胞因子間接殺傷腫瘤。 臨床應(yīng)用：由于其體外增殖活性不強，體內(nèi)抗瘤活性有限，且為維持LAK細胞體內(nèi)活性，需要注射大劑量IL-2，而出現(xiàn)較強毒副作用，因此逐漸淡出臨床應(yīng)用。,淋巴因子激活的殺傷細胞,腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL）是從腫

9、瘤部位分離出的一群淋巴細胞，經(jīng)IL-2等細胞因子擴增后產(chǎn)生。 其表型以CD4+T細胞和CD8+T細胞為主，具有一定的腫瘤特異性和MHC限制性。TIL的抗腫瘤效果是LAK的50100倍。 臨床應(yīng)用：TIL已應(yīng)用于臨床試驗，主要治療皮膚、腎、肺、頭頸部、肝、卵巢部位的原發(fā)或繼發(fā)腫瘤。但其取材不便和制作過程的相對復(fù)雜性限制了其在臨床的應(yīng)用。,腫瘤浸潤性淋巴細胞,細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK）是外周血單個核細胞經(jīng)抗CD3單克隆抗體，以及IL-2、IFN-和IL-1等細胞因子體外誘導(dǎo)分化獲得的NK樣T細胞。 CIK呈CD3+CD56+表型，既

10、具有NK細胞的非MHC限制性特點，又有T淋巴細胞抗腫瘤活性。具有增殖速度快，殺傷活性高，腫瘤殺傷譜廣等優(yōu)點。 臨床應(yīng)用：目前發(fā)現(xiàn)CIK在腎癌、肝癌、肺癌、白血病等多種腫瘤中具有抗瘤活性。,細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞,NK細胞可識別MHC-I表達下調(diào)或缺失的腫瘤細胞，無需抗原預(yù)先致敏即可以直接殺傷腫瘤細胞，其殺傷腫瘤細胞的機制有： 通過分泌穿孔素、顆粒酶來殺傷腫瘤細胞；通過死亡配體介導(dǎo)靶細胞凋亡；分泌炎癥因子間接殺傷腫瘤細胞；通過ADCC效應(yīng)殺傷腫瘤細胞。 臨床應(yīng)用：隨著純化技術(shù)及擴增技術(shù)的不斷改進，NK細胞逐漸成為過繼性免疫治療重要組成部分。NK細胞目前仍處于/期臨床試驗階段。,NK細胞,T細胞是

11、一類T細胞，因其TCR由和肽鏈組成而被命名，多為CD4-CD8-雙陰性表型。其殺傷腫瘤細胞的機制非常復(fù)雜，主要涉及到穿孔蛋白途徑和Fas/FasL介導(dǎo)的細胞凋亡途徑，也可以通過NK樣的受體，使之像NK細胞一樣可直接識別蛋白質(zhì)或肽類抗原，以非MHC限制性方式殺傷腫瘤細胞。 臨床應(yīng)用：以T細胞為基礎(chǔ)的免疫治療在肺癌、腎癌、惡性黑色素瘤等期臨床研究中已顯示出良好效果，尤其是轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤，提示其可能成為腫瘤治療的新途徑。,T細胞,三、非特異性免疫調(diào)節(jié)劑治療,（一）效應(yīng)細胞刺激劑 刺激活化免疫效應(yīng)細胞,（二）免疫負調(diào)控抑制劑 抑制免疫負調(diào)控細胞或分子,干擾素 具有免疫調(diào)節(jié)、抗增殖、誘導(dǎo) 分化、促凋

12、亡、抗血管生成等 多種作用，是第一個被證實具 有抗腫瘤活性的細胞因子,咪喹莫特 是Toll樣受體7（toll-like receptor 7，TLR7）的激動劑 ，能增強固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性 免疫應(yīng)答,效應(yīng)細胞刺激劑,IL-2 是調(diào)控T細胞和NK細胞等淋巴細胞生長的重要因子,卡介苗 既可以激發(fā)固有免疫應(yīng)答，又可以激發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答,（一）效應(yīng)細胞刺激劑,Denileukin diftitox 由IL-2的受體結(jié)合片斷與具有酶活性的白喉毒素跨膜片段重組融合，與IL-2受體（CD25）結(jié)合后，被攝取進入胞漿，裂解釋放白喉毒素A鏈，持續(xù)抑制蛋白的合成，導(dǎo)致細胞死亡。,CTLA-4單克隆抗體 Ipil

13、imumab和tremelimumab都是CTLA-4人源化單克隆抗體，主要通過抑制活化T細胞的CTLA-4與抗原遞呈細胞的B7結(jié)合，打破免疫耐受，增強T細胞的活性。,（二）免疫負調(diào)控抑制劑,PD-L1抗體 PD-1是程序性死亡受體-1，大部分表達于活化T細胞表面，為免疫抑制性受體，與其配體PD-L1、PD-L2相互作用傳遞抑制性信號，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負向調(diào)控作用。由于腫瘤細胞高表達PD-L1，故阻斷PD-L1與PD-1的結(jié)合可阻止此種機制介導(dǎo)的免疫抑制作用。,（二）免疫負調(diào)控抑制劑,嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）T細胞技術(shù)； 是過繼細胞免疫治療（

14、adoptive cellular immunotherapy，ACI)的一種； 通過基因改造技術(shù)，讓患者T細胞表達嵌合抗原受體，使效應(yīng)T細胞的靶向性、殺傷性和持久性均較常規(guī)應(yīng)用的免疫細胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和打破宿主免疫耐受狀態(tài)； 是一種特異性的免疫細胞抗腫瘤治療。,什么是CAR-T細胞,T淋巴細胞是腫瘤細胞的天敵，在腫瘤免疫應(yīng)答中起重要作用，對腫瘤細胞有極強的殺傷作用。 對T細胞進行基因工程處理，從而在其表面表達能夠識別特異性腫瘤抗原的特殊受體稱為嵌合抗原受體（CAR），同時在受體的胞內(nèi)段可加上引起T細胞活化的信號傳遞區(qū)域。 腫瘤對患者的免疫系統(tǒng)具有抑制作用，限制了自身免疫功

15、能的誘導(dǎo)和激活，因此可以把患者的免疫細胞放到一種可以避開腫瘤抑制因素的環(huán)境中進行激活和擴增，然后再將擴增后的免疫細胞回輸患者，從而使患者的免疫功能迅速增強，達到殺傷腫瘤細胞的作用，這種療法就是過繼性免疫療法,嵌合抗原受體（CARs）是由一個胞外抗原識別域（通常是一個單鏈抗體，也可以是多肽或者其他蛋白質(zhì)）和一個胞內(nèi)信號域組成。CAR的胞外部分用來識別特異性的腫瘤抗原，隨后胞內(nèi)信號域會刺激T細胞增殖，并且通過細胞溶解和細胞因子釋放來消除腫瘤細胞。,第一代CARs的胞內(nèi)信號域是CD3信號鏈（signal 1），這一代產(chǎn)品在臨床試驗中效果有限，可能由于移植T細胞的活化誘導(dǎo)細胞死亡（AICD）或者T細胞

16、擴增的持續(xù)性不好所導(dǎo)致。 第二代CARs相比第一代CARs增加了一個胞內(nèi)共刺激信號域（signal 2）。在過去的5年里，對于第二代含有CD28或者4-1BB(CD137) 共刺激信號域的抗CD19 CAR-T，在治療B淋巴細胞白血病的臨床試驗中都表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，但是仍然需要尋找更好的共刺激信號分子，來解決第二代CAR-T產(chǎn)品作用不持久等問題。 第三代CARs不僅包含CD3信號域，還包括兩個共刺激信號分子（圖1），這些共刺激信號分子主要包括CD28、4 -1BB以及OX40 (CD134)等，在臨床前研究中發(fā)現(xiàn)第三代CAR-T細胞療法效果要優(yōu)于第二代產(chǎn)品,CAR構(gòu)成（1）-scFV（單鏈抗體

17、）,識別腫瘤表面抗原,特異性,CAR構(gòu)成（2）-TCR/CD3/,產(chǎn)生信號，激活T淋巴細胞,有效性,CAR構(gòu)成（3）- co-stimulator,增殖與存活,加入CD28，產(chǎn)生IL-2等,加入CD137（4-1BB）， 增強多種能力,CD28是T細胞表面的一個蛋白，能夠為T細胞提供共刺激信號，對T細胞的活化和存活具有重要作用。T細胞刺激信號通過CD28，能夠促進多種白介素的分泌。,CD137，又被稱作4-1BB、TNFRSF9等，它是TNF受體家族成員。CD137表達于活化后的T細胞，也表達于樹突細胞，濾泡樹突狀細胞、NK細胞、粒細胞以及炎癥位置的血管壁細胞等。 CD137可以作為共刺激信號

18、激活T細胞，能夠增強T細胞的增殖、存活能力、細胞裂解作用以及IL-2分泌等。,第一代CAR-T細胞 發(fā)表時間：1989年； 嵌合受體的形成方法： Eshhar研究小組將免疫球蛋白樣scFv和FcRI受體(鏈)或CD3復(fù)合物(鏈)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合形成嵌合受體； 激活方式：表達CAR的T細胞以抗原依賴、非MHC限制的方式結(jié)合腫瘤抗原, 啟動并活化特異性殺傷腫瘤反應(yīng)； CARs表達的穩(wěn)定性依賴于所用的胞內(nèi)信號域； 大多數(shù)試驗在細胞擴增、體內(nèi)存活時間、細胞因子分泌等方面存在不足，治療效果不明顯。,CAR-T細胞的發(fā)展過程,第二代CAR-T細胞 發(fā)表時間：2010年； 嵌合受體的形成方法：T細胞的完全活化

19、有賴于雙信號*和細胞因子的作用。因此，依照T細胞活化的雙信號學(xué)說, 第二和第三代CARs 在嵌合受體上加上如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子(costimulatory molecule, CM)，以提高T細胞的細胞毒性、增殖活性, 維持T細胞應(yīng)答, 延長T細胞存活時間等（圖2）； CD28、CD134對提高初始T細胞獲得持久的體外增殖和較強的細胞因子分泌非常重要 ； 在治療慢淋中觀察到：體內(nèi)擴增1000倍以上,而且在血液和骨髓中存活的時間也超過6個月, 分泌的細胞因子如干擾素-、CXCL9等較治療前顯著增高。,CAR-T細胞的發(fā)展過程,T細胞激活需要雙信

20、號,第一信號為特異性信號, 由TCR識別抗原遞呈細胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物所啟動; 第二信號為協(xié)同刺激信號, 通過CD28/B7等重要的共刺激分子, 促進IL-2合成, 并使T細胞充分活化及免于凋亡。,第三代CAR-T細胞 發(fā)表時間：2012年； 嵌合受體的形成方法：以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體構(gòu)建第三代CAR-T細胞(scFv CD20-CD28-CD137-CD3）； 兩個共刺激因子，進一步提高細胞增殖能力及細胞毒性 患者輸注后4小時血液就檢測出有高水平的IFN-、GM-CSF、TNF-和IL-6等細胞因子； 效應(yīng)細胞在體內(nèi)存活的時間超過12個月； 由于目前第三代CAR-T細胞臨床應(yīng)用還比較少,

21、 故其安全性和有效性是否就一定優(yōu)于第二代CAR-T細胞, 以及選擇怎樣的共刺激分子組合, 還需進一步觀察。,CAR-T細胞的發(fā)展過程,2nd 病毒載體的轉(zhuǎn)移效率高, 培養(yǎng)T細胞到達臨床數(shù)量的時間相對較短, 且不同病毒載體具有不同表達特點，故在基礎(chǔ)研究和臨床試驗中應(yīng)用廣泛，是目前主要的基因治療載體。約70%的治療方案采用病毒載體。目前最常用的主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體等； 非病毒載體有裸DNA、脂質(zhì)體、多聚物分子耦聯(lián)體等； 近年來,，微環(huán)DNA被認為是最好的非病毒載體之一, 在基因治療中已被廣為應(yīng)用。,CAR-T細胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法,CAR-T細胞臨床應(yīng)用中的問題,CAR-T細胞的脫靶效應(yīng)(OFF-TARGET EFFECT) 是細胞對設(shè)計之外的額外靶點的作用，導(dǎo)致針對正常組織的自身免疫病反應(yīng)。 原因：