1、石蠟切片實(shí)驗(yàn)操作練習(xí)詳細(xì)指導(dǎo)提供給實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)用品及每個小組的用量：1、 器材切片刀，切片機(jī)，恒溫箱，溫臺，熔蠟爐，蠟杯，酒精燈，蠟鏟，展片臺，解剖刀，解剖針，解剖剪，解剖盤，培養(yǎng)皿，吸管，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，蓋玻片，載玻片，玻片盤，樹膠，樹膠瓶，顯微鏡，溫度計，臉盆，水浴鍋。2、 試劑卡諾氏固定液、FAA固定液、各種濃度的酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟、埃利希蘇木精染液， 1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸酒精溶液，甘油蛋白粘片劑，郝普特氏粘片劑，中性樹膠。1%番紅，1%固綠，1%過碘酸，Schiff試劑，0.5%偏重亞硫酸鈉溶液，醋酸酐-吡啶混合液，0.5%1%淀粉糖化

2、酶溶液。3、 材料鼠肝、腎、心肌、骨骼肌或其他組織、大豆或小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆的根、莖、葉等。4、 每個實(shí)驗(yàn)小組的用量(一)器材切片機(jī)，切片刀，溫臺，恒溫箱，熔蠟爐，水浴鍋等這類幾個小組用一臺就行；解剖刀，單面刀片，小臺木，毛筆一只，蠟鏟一個，蓋玻片和載玻片30個，臉盆一個，酒精燈各一個，包埋紙盒23個，染色缸一個，瓷杯3個，顯微鏡一臺。（二）試劑FAA固定液50ml、1%番紅100ml、1%固綠100ml、1%過碘酸100ml、Schiff試劑100ml、亞硫酸鹽300ml、醋酸酐-吡啶混合液100ml、0.5%1%淀粉糖化酶溶液200ml，石蠟半盒、蜂蠟10塊、埃利希蘇木精染液10

3、0ml、1%伊紅酒精溶液100ml、1%鹽酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶，甘油蛋白粘片劑數(shù)滴，中性樹膠數(shù)滴。（三）材料小白鼠一只、蠶豆種，小麥和大豆種1020粒，洋蔥和大蒜由實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一種，然后取其所需部分。石蠟切片法實(shí)例（一）蘇木精-伊紅對染法一、目的要求1、 熟悉石蠟切片的制作過程。2、 掌握HE染色的基本原理和染色方法。二、實(shí)驗(yàn)原理石蠟切片是最基本的切片技術(shù)，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。蘇木素與伊紅對比染色法（簡稱H.E.對染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛，對組織細(xì)胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構(gòu)造，而且適用于各種固定

4、液固定的材料，染色后不易褪色可長期保存。經(jīng)過HE染色，細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。三、實(shí)驗(yàn)用品（一） 器材切片機(jī)，切片刀，溫臺，恒溫箱，解剖刀，鑷子，剪刀，解剖針，單面刀片，小臺木，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，燒杯，水盆，熔蠟爐，蠟杯。（二） 試劑卡諾（Carnoy）固定液，埃利希蘇木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸乙醇液，各級酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。試劑配法：1、卡諾氏固定液：100%酒精3份冰醋酸 1份或：100%酒精6份氯仿 3份冰醋酸 1份2、埃利希蘇木精染液的配法：蘇木精 1g純酒精

5、50ml冰醋酸 5 ml甘油 50 ml鉀礬（硫酸鋁鉀）約5g（飽和量）蒸餾水 50 ml配法：、將蘇木精溶于約15 ml的純酒精中，再加冰醋酸后攪拌。、當(dāng)蘇木精溶解后即將甘油倒入并搖動容器，同時加入其余的酒精。、將鉀礬在研缽中研碎并加熱，然后將它溶解于水中。、將溫?zé)岬拟浀\溶液一滴一滴地加入上述染液中，并隨時攪動。、此液混合完畢，將瓶口用一層紗布包著小塊棉花塞起來，放在暗處通風(fēng)的地方，并經(jīng)常搖動以促進(jìn)它的成熟。成熟時間約34周。若加入0.2g碘酸鈉，可立刻成熟。此液穩(wěn)定而染色均勻，染核效果良好，不會發(fā)生沉淀，長期貯備無妨。此液可分別與伊紅等進(jìn)行二重染色。3、1%伊紅酒精溶液：伊紅1g溶于100

6、 ml95%酒精溶液。4、1%鹽酸乙醇液鹽酸 1份70%酒精 100份5、甘油蛋白貼片劑：蛋白 50 ml甘油 50 ml水楊酸鈉（防腐劑） 1g配制時將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調(diào)打成雪花狀泡沫，然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經(jīng)數(shù)小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。最后加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用。可保存幾個月。（三） 材料鼠肝三、實(shí)驗(yàn)程序1、 取材頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或小腸）。切取的組織塊不宜太大，以便固定劑穿透，通常以5mm5mm2mm或10 mm10 mm2 mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小

7、塊23mm厚。取材的注意事項：（1）取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細(xì)胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。（2）切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。2、固定將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入卡諾固定液中固定，固定3050min。固定的注意事項：（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學(xué)變化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的2030倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換12次新液。（4）材料

8、固定完畢后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標(biāo)簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽，以免相互混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來源、日期等。標(biāo)簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。1、 洗滌材料經(jīng)固定后，除乙醇外，組織中的固定液必須沖洗干凈，尤其是含有重金屬的固定液。因?yàn)闅埩粼诮M織中的固定液，有的不利于染色，有的產(chǎn)生沉淀或結(jié)晶影響觀察。沖洗方法根據(jù)固定液的性質(zhì)而定，固定液為水溶液的常用水洗滌，固定液含有乙醇的則用50%70%乙醇沖洗。2、 脫水30%、50%、70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水各40min，放入95%、100%各兩面三刀次，每次20min。各種材料經(jīng)固定與洗滌后，

9、組織中含有大量水分，由于水與石蠟不能互溶，所以必須將組織中的水分除去。脫水注意事項（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分。（2）在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。（3）在低濃度或純酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。（5）如需過夜，應(yīng)停留在70%酒精中。（6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象5、透明純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或

10、至透明為止），須換一次二甲苯。由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。透明注意事項（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進(jìn)入。（2）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。（3）在透明過程中， 如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。6、透蠟放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟、石蠟透蠟各2030分鐘。透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)

11、部達(dá)到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織的透蠟時間較長，約需12d。透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，并保持箱內(nèi)溫度在5560左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。置于恒溫箱0.5h。透蠟注意事項（1）盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度；（2）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；（3）操作要迅速，力求在最短的時間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。1、 包埋將經(jīng)過透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入容器內(nèi)，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蠟塊。用于包埋的石蠟的熔點(diǎn)在5060之間，包埋時應(yīng)根據(jù)組織材料、切片厚度、氣候條件等因素，選擇不同熔點(diǎn)的石蠟。一般動物材料常用的石蠟熔點(diǎn)為5256，植物

12、材料用的石蠟熔點(diǎn)為5458。包埋的操作過程包埋時，將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯3，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。輕輕將紙盒兩側(cè)的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋塊迅速凝固。待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。2、 切片將已固定和修好的石蠟塊臺木裝在切片機(jī)的夾物臺上。將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到

13、所需的切片厚度，一般為410微米。一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以4050r/min。切成的蠟帶到2030cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機(jī)擦拭干凈妥為保存。3、 貼片、取一片清潔的載玻片，滴一滴粘片劑于玻片中央，然后用洗凈的手指加以涂抹，便成均勻薄層。、滴12滴的蒸餾水已涂粘片劑的載玻

14、片上。、用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在水面上，注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標(biāo)簽。、把玻片擺好片位置，在酒精燈火焰上方適度加熱至蠟片舒展。或放置置于預(yù)先加熱的展片臺上（溫度保持在4045）。此時蠟片因受熱而伸展攤平。并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標(biāo)簽。、展片后把載玻片放在平盤上編好記號置于37溫箱烘干，一晝夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。10、脫蠟復(fù)水石蠟切片經(jīng)二甲苯、脫蠟各510min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各級酒精溶液中各35min，再放入蒸餾水中3min。染色液多數(shù)為水溶液，因此，染色前必須將蠟脫

15、去，使切片中的材料由有機(jī)相進(jìn)入到水相。一般采用二甲苯脫蠟，逐級復(fù)水與脫水浸蠟過程正好相反，但是，由于蠟片較薄，所需時間比脫水浸蠟要短的多。11、染色切片放入蘇木精中染色約1030min。染色時間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當(dāng)縮短或延長。室溫高時促進(jìn)染色，染色時間可短些，否則可適當(dāng)延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。12、水洗用自來水流水沖洗約15min。沖洗過程中使切片顏色發(fā)藍(lán)（或放入堿性水中也可，但用促藍(lán)劑對伊紅可能拒染，如果時間來得及，應(yīng)以流水沖洗使切片顯示藍(lán)色為宜），但要注意流水不能過大，以防切片脫落，并隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍(lán)為止。13、分化就是將細(xì)胞質(zhì)著的色褪去，使細(xì)

16、胞核著色更加鮮明，也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液（鹽酸1份+70%乙醇100份）中褪色，見切片變紅，顏色較淺即可，約數(shù)秒至數(shù)十秒鐘。這一步驟是H.E.染色成敗的關(guān)鍵，如分化不當(dāng)會導(dǎo)致染色不勻，或深或淺，得到的切片染色效果差。如果染色適中，可取消此步驟。14、漂洗切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。低倍鏡檢查見細(xì)胞核呈藍(lán)色、結(jié)構(gòu)清楚；細(xì)胞質(zhì)或結(jié)締組織纖維成分無色為標(biāo)準(zhǔn)。然后放入蒸餾水中漂洗一次。15、脫水切片入50%乙醇70%乙醇80%乙醇中各35min。16、復(fù)染用0.5%伊紅乙醇液對比染色25min。伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合，如果細(xì)胞核染色較濃，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)

17、濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細(xì)胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。17、脫水放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中35min。最后用吸水紙吸干多余的乙醇。18、透明切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中約5min，然后放入純二甲苯、中各35min。二甲苯應(yīng)盡量保持無水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。19、封藏：中性樹膠封存切片經(jīng)染色、脫水、透明后，即可用封藏劑將其封藏起來，目的是永久保存切片，便于鏡檢

18、。常用的封藏劑一類為干性封藏劑如中性樹膠、加拿大樹膠等，另一類為濕性封藏劑如甘油明膠等。如果切片是經(jīng)二甲苯透明，則用樹膠作為封藏劑，樹膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠度。如果切片是直接從水中或水溶液中取出，則常用甘油明膠作為封藏劑，可用于短期保存標(biāo)本。封藏的方法：封片前應(yīng)根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透明后，按照下列方法進(jìn)行封藏。在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進(jìn)行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免

19、產(chǎn)生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補(bǔ)足。如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。染色結(jié)果：細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。實(shí)驗(yàn)報告1、簡述石蠟切片的主要過程。2、分析影響HE染色的主要因素。石蠟切片法實(shí)例（二）番紅-固綠對染法一、目的要求1、 熟悉植物石蠟切片的制作過程。2、 掌握番紅-固綠對染法的基本原理和具體方法。二、實(shí)驗(yàn)原理石蠟切片法也是在研究植物細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片，又可以切成連續(xù)薄片，切片經(jīng)染色，觀察效果甚好。番紅-固綠對染法，為植物制片上最普遍的一種二重染色法，其染色程序簡

20、單并能清晰地顯示出細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。番紅為堿性染料，能使細(xì)胞核及木質(zhì)化的細(xì)胞壁染成紅色；固綠為酸性染料，能使細(xì)胞質(zhì)及纖維素的細(xì)胞壁染成綠色。三、實(shí)驗(yàn)用品（一） 器材切片刀，切片機(jī)，溫箱，溫臺，解剖刀，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，蠟鏟，酒精燈，包埋紙盒，染色缸，玻片盤，溫度計，臉盆。（二）試劑FAA固定液，1%番紅，1%固綠，各級酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，石蠟，郝普特氏明膠粘片劑，樹膠。試劑配法：1、FAA固定液（福爾馬林-醋酸-灑精混合液）福爾馬林 5 ml50%或70%的灑 90 ml冰醋酸 5 ml此液適用于植物組織，此液中的酒精，有用50%的，也有用70%的，一般薄嫩的材料右用50%的，厚硬的材料用70%的，醋酸的用量也可根據(jù)材料情況作適當(dāng)?shù)母淖儯瑢σ恍┐髩K而密實(shí)的組織可增加用量，同時減少福爾馬林的用量。固定時間可因材料及醋酸含量的變化而異，一般為520h。固定的材料，一般無需用水洗，可直接從70%的酒精開始脫水。1、 1%番紅番紅1g溶于100ml水中。2、 1%固綠1g固綠溶于100ml95%酒精中。3、 郝普特氏明膠粘片劑明膠 1g蒸餾水 100ml石炭酸 2g甘油 15ml配制時先將明膠溶解于30的蒸餾水中（在水浴鍋內(nèi)進(jìn)行），待溶