1、極性物質(zhì)分離、高含水流動(dòng)相和相塌陷等問題反相色譜是迄今應(yīng)用最廣泛的HPLC分離模式，通過熟練控制流動(dòng)相，譬如改變有機(jī)溶劑種類、溶劑組成和pH值，添加表面活性劑、手性試劑和離子對(duì)試劑，或者調(diào)節(jié)流速和溫度等操作條件，廣大色譜工作者單用C18固定相就成功實(shí)現(xiàn)了許許多多的色譜分離。一連串的成功沖昏了頭腦，色友們一度認(rèn)為他們只需要僅僅幾種固定相，憑借控制上面這些數(shù)量眾多的神奇參數(shù)，就可以打遍天下無敵手，解決所有碰到的色譜分離問題。抱著這種想法，碰壁是無疑的，他們也有了無論怎么調(diào)節(jié)參數(shù)都束手無策的時(shí)候，既不能找到必要的選擇性，也不容易獲得良好且有重現(xiàn)性的分離。后來，新的固定相和新的表面修飾和鍵合方法每年就

2、有不斷推出。為解決PH4-8時(shí)分析堿性化合物的拖尾問題，二十多年前，在低純度的A型硅膠基質(zhì)上，推出過一系列堿去活表面處理方法（BDS）做出的固定相；以后進(jìn)一步推出了目前普遍使用的以高純度的B型硅膠為基礎(chǔ)的各類固定相。又后來,為解決高pH（10）和低pH（2）條件使用時(shí)固定相和色譜柱的穩(wěn)定問題,也推出了一些新固定相和填料表面修飾處理新工藝,如SB固定相、雙齒鍵合、雜化和聚合物包覆等等。 言歸正傳，對(duì)于極性非常強(qiáng)的化合物，面臨的是不同的問題。因?yàn)槿芙舛鹊囊蛩?，許多極性化合物更適宜用高含水的流動(dòng)相，而且只能在有機(jī)相濃度極小的情況下有保留能力，有時(shí)有機(jī)相必須小于5%。隨之而來就產(chǎn)生了相塌陷的問題，以及

3、找尋解決這個(gè)問題的固定相改進(jìn)方法，以實(shí)現(xiàn)用高含水流動(dòng)相，甚至是100%水流動(dòng)相，成功分離高極性化合物的目標(biāo)。下面將詳細(xì)介紹有關(guān)相塌陷的現(xiàn)象、其對(duì)色譜性能的影響、形成原因和機(jī)理、避免和修復(fù)處理方法以及從根本上消除這種影響的產(chǎn)品層面（固定相改進(jìn)）的解決方案。一、相塌陷的經(jīng)典解釋反相色譜中固定相通常疏水性都很強(qiáng),特別是長鏈烷烴高密度鍵合的情況下,疏水性更強(qiáng)。在高含水量的流動(dòng)相環(huán)境下，固定相的疏水長碳鏈傾向于通過互相結(jié)合的方式盡量降低表面自由能，固定相的互相結(jié)合的結(jié)果使填料多孔結(jié)構(gòu)的表面“失濕”，也就是不能很好被流動(dòng)相潤濕了。這個(gè)時(shí)候，在流動(dòng)相中的極性待分析物就很難通過吸附擴(kuò)散等作用接近固定相表面而發(fā)

4、生相互作用，色譜保留能力就沒有了，就是發(fā)生“相塌陷”了,也有人稱之為“鏈折疊”或“固定相倒伏”。圖一所示：（a）是在甲醇水流動(dòng)相下的碳鏈形狀；（b）是100%水 圖一流動(dòng)相下的碳鏈形狀。相塌陷會(huì)造成保留時(shí)間減少、保留時(shí)間沒有重現(xiàn)性、拖尾程度增加以及梯度再生恢復(fù)時(shí)間變長等色譜性能變壞的問題。很多因素會(huì)影響保留時(shí)間減少的速率和程度，包括鍵合烷基鏈的類型、鍵合密度和硅膠孔徑。當(dāng)固定相的鍵合密度比較低的時(shí)候（小于3umol/m2），相塌陷不是個(gè)問題，因?yàn)闅埩粼诠枘z表面的硅醇基能使填料表面被水分子潤濕，使烷基鏈有機(jī)會(huì)和極性待分析物中的疏水部位發(fā)生作用。當(dāng)鍵合相是C3之類的短鏈烷基時(shí)，相塌陷也極少發(fā)生，因

5、為烷基鏈的體積小，對(duì)親水性的硅醇基的屏蔽作用不明顯。二、兩個(gè)研究實(shí)例Kazakevichi，LoBrutto等人系統(tǒng)地研究過不同的烷基鏈固定相的塌陷問題，他們的研究結(jié)論是：如果不考慮有機(jī)相的存在比例，烷基鏈處于塌陷狀態(tài)是最穩(wěn)定的。流動(dòng)相中的各組分在固定相中聚積量實(shí)際上和烷基鏈的長度無關(guān)。他們觀察到，當(dāng)用100%水流動(dòng)相低流速?zèng)_洗烷基鏈反相色譜柱過夜后，用尿嘧啶等出峰實(shí)際測(cè)得的死體積要低于原先預(yù)估的死體積。這歸因于水的表面張力大，100%水流動(dòng)相不能進(jìn)入硅膠內(nèi)部的小孔所致。用高含量乙腈流動(dòng)相沖洗至少3小時(shí)后，原先的死體積又可以恢復(fù)。按照LapLace-Young方程，P=4COS/d（這里的P是

6、流動(dòng)相進(jìn)入小孔需要的壓力, 是表面張力, 是流動(dòng)相和填料表面的接觸角,d是孔的有效直徑），液體表面張力越大，液體和固體表面親水疏水性質(zhì)相差越大（接觸角大），小孔的有效孔徑越小，流動(dòng)相進(jìn)入孔內(nèi)部的難度就越大。Przybyciel和Santangelo用阿莫西林（一種抗生素，極性物質(zhì)）做了試驗(yàn)，結(jié)果見圖二。所用色譜柱為C8柱，初期用水乙腈流動(dòng)相沖洗直至基線穩(wěn)定，然后轉(zhuǎn)換到0.1%的醋酸流動(dòng)相（不含任何有機(jī)相），（a）圖顯示阿莫西林保留時(shí)間是8.6分鐘；關(guān)掉泵讓儀器休息10分鐘，用同樣的流動(dòng)相并重新進(jìn)樣，（b）圖顯示保留時(shí)間只有3.5分鐘了，而且峰形也變得很差。三、如何使已經(jīng)產(chǎn)生相塌陷柱子的色譜性能

7、得到恢復(fù)?有一點(diǎn)需要首先強(qiáng)調(diào)，相塌陷并沒有根本上毀壞色譜柱，是很容易恢復(fù)的。還是從LapLace-Young方程(P=4COS/d),我們就可以自然地想到恢復(fù)相塌陷柱子性能的方案。一個(gè)是系統(tǒng)提供足夠大的P,強(qiáng)力將高含水流動(dòng)相或100%水流動(dòng)相壓入硅膠的小孔內(nèi),使流動(dòng)相潤濕小孔,使待測(cè)物分子有機(jī)會(huì)和小孔內(nèi)的疏水烷基鏈發(fā)生保留作用，圖（c）就是Przybyciel和Santangelo對(duì)柱子加壓270bar，持續(xù)10分鐘后進(jìn)樣的恢復(fù)結(jié)果，阿莫西林的保留時(shí)間恢復(fù)到了7.8分鐘，可能加壓還不夠大的原因，沒有完全恢復(fù)到原來8.6分的保留水平；另外一個(gè)方案就是用COS值小的流動(dòng)相替換高含水流動(dòng)相,進(jìn)入孔內(nèi)

8、對(duì)烷基固定相進(jìn)行再溶劑化和重新潤濕，從而恢復(fù)色譜保留能力。他們用60：40的乙腈水以1ml/min的流速?zèng)_洗已經(jīng)相塌陷的C8色譜柱30分鐘，然后用0.1%的醋酸流動(dòng)相測(cè)定阿莫西林，圖（d）顯示保留能力已完全恢復(fù)到原來水平，說明水有機(jī)混合流動(dòng)相表面張力低，很容易在正常儀器操作壓力條件下，進(jìn)入小孔潤濕C8烷基鏈。不過，0.1%醋酸流動(dòng)相如果持續(xù)流過已經(jīng)恢復(fù)正常保留能力的色譜柱，隨著填料小孔內(nèi)殘留乙腈的不斷減少，相塌陷現(xiàn)象又會(huì)重現(xiàn)，保留時(shí)間又會(huì)慢慢下降。（e）圖則是兩位研究者用專門設(shè)計(jì)在高含水流動(dòng)相條件下應(yīng)用的色譜柱做的對(duì)比圖譜，保留時(shí)間7.5min，阿莫西林峰形也非常漂亮。特別的地方是，這種柱子可

9、以在100%水流動(dòng)相，在正常的操作壓力下，不會(huì)發(fā)生相塌陷，能保持保留能力的穩(wěn)定。四、解決高含水流動(dòng)相下極性物質(zhì)的保留問題，固定相設(shè)計(jì)的幾種方案1.選用短鏈烷基鍵合相且不對(duì)硅醇基封尾2.選用親水性和極性很強(qiáng)的封尾試劑封尾3.對(duì)烷基鏈固定相進(jìn)行極性基團(tuán)嵌入的改造4.選用鏈長更長的烷基固定相5.選用大孔硅膠下面將詳細(xì)介紹這幾種產(chǎn)品層面的解決方案。1.選用短鏈烷基鍵合相且不對(duì)硅醇基封尾硅膠表面殘留硅醇基對(duì)色譜性能的不利影響已經(jīng)是眾所皆知,pH5以上硅醇基離子化,離子交換作用的存在可導(dǎo)致堿性化合物的峰形嚴(yán)重拖尾。但任何事情都有正反兩面，這里要著重說一下硅醇基存在的正面作用。殘留硅醇基賦予了反相填料表面一

10、定程度的極性，當(dāng)僅憑烷基鏈不能提供足夠的色譜分離選擇性時(shí)，硅醇基和分析物極性部位的極性相互作用導(dǎo)致的混合作用機(jī)制可以改善色譜分離的效果。不過，若非嚴(yán)格保持鍵合相和殘留硅醇基的比例每次一樣，批與批之間的重現(xiàn)性很難控制。Kasakevich等人的研究表明：C鏈小于4個(gè)的短鏈烷基相發(fā)生相塌陷的可能性很小，這種情況下起主導(dǎo)作用的分離機(jī)制是分析物吸附到烷基鏈上（而不是擴(kuò)散）以及分析物和硅醇基的極性相互作用。2.選用親水性和極性很強(qiáng)的封尾試劑封尾短鏈烷基相畢竟應(yīng)用局限性很大，大部分情況還是會(huì)用到C4以上的烷基鍵合相，此時(shí)封尾試劑和工藝的選擇就很重要。選擇合適的極性或親水性的封尾試劑，可以使填料表面容易被水

11、潤濕，充分發(fā)揮長鏈烷基鍵合相的和分析物的保留作用能力。市場(chǎng)上銷售的采用這種工藝的商品色譜柱很多，如熱電的Aquasil C18，Alltech的Alltima AQ-C18，YMC的Hydrosphere C18，Waters的Polaris dC18等等。月旭公司的極限系列產(chǎn)品中，Ultimate AQ-C18也屬于此類。各個(gè)廠家具體使用什么類型的極性封尾試劑和何種鍵合工藝，屬于商業(yè)秘密，很少有資料提及，但普遍認(rèn)為這些封尾試劑的封尾作用方式和傳統(tǒng)的封尾試劑如三甲基氯硅烷類似。3.對(duì)烷基鏈進(jìn)行極性基團(tuán)嵌入的改造就是先將烷基相進(jìn)行極性基團(tuán)嵌入的改造后，再鍵合到硅膠表面上。改造的部位應(yīng)該是烷基相接

12、近硅膠表面的碳原子處。極性基團(tuán)的嵌入，使烷基相在流動(dòng)相中有機(jī)相比例極低時(shí)（甚至100%水流動(dòng)相時(shí)）也能被水溶劑化潤濕，不會(huì)發(fā)生相塌陷現(xiàn)象。另外極性基團(tuán)嵌入在硅膠表面不遠(yuǎn)的地方，對(duì)硅醇基的屏蔽作用也十分有效，不易造成峰形拖尾。所以這種工藝只需一部工藝，將預(yù)先嵌入極性基團(tuán)的烷基鏈鍵合到硅膠表面即可，省略了一般有的第二步封尾工序。因?yàn)榉馕不鶊F(tuán)容易在酸性條件下水解脫落，這種無封尾工藝生產(chǎn)的填料就有了耐酸的特性，可以在低pH條件下使用。尿嘧啶因?yàn)椴辉诖蠖鄶?shù)反相柱上有保留，通常用作死體積的標(biāo)定試劑。但在乙醚基嵌入的烷基固定相或者極性基團(tuán)封尾過的填料，在100%水流動(dòng)相條件下，尿嘧啶是有保留的，出峰時(shí)間甚至

13、在5-氟胞嘧啶和胞嘧啶之后(見圖三)。嘌啉和嘧啶等堿性物質(zhì)、小分子有機(jī)酸、兒茶酚胺以及水溶性維生素的測(cè)定常常需要用高含水流動(dòng)相。市場(chǎng)上采用極性基團(tuán)嵌入工藝的產(chǎn)品有：Supelco的Discovery amide C16，EKA的Kromasil Amide C8，Waters的Symmetry Shield RP18，Agilent的Zorbax Bonus-RP等。最早的報(bào)道是日本的野村成功將酰氨嵌入烷基鏈，具體過程見圖四。發(fā)展到今天市場(chǎng)上采用極性基團(tuán)嵌入工藝的產(chǎn)品已經(jīng)有很多，包括：Supelco的Discovery amide C16，EKA的Kromasil Amide C8，Water

14、s的Symmetry Shield RP18，Agilent的Zorbax Bonus-RP以及Supelco的ABZ等,嵌入烷基鏈的極性基團(tuán)包括醚基、氨基、?；?、脲基和酰胺基等不同，月旭公司也將會(huì)在不久后推出自己獨(dú)有的極性基嵌入工藝的純水柱產(chǎn)品。烷基鏈嵌入極性基團(tuán)的純水柱和用極性基團(tuán)封尾的純水柱相比，有如下特點(diǎn)或者應(yīng)用上的差異：1).盡管嵌入了極性基團(tuán),但固定相仍然保持反相特性2).與普通AQ純水柱的純粹烷基固定相比較,因?yàn)榍度肓藰O性基團(tuán),選擇性會(huì)有不同,特別是在測(cè)定極性物質(zhì)時(shí)。3).硅醇基活性被極性基屏蔽,不易拖尾,峰形更佳。4).因?yàn)闆]有進(jìn)行過封尾工藝,酸性條件下應(yīng)用更穩(wěn)定用一個(gè)應(yīng)用實(shí)例

15、來說明極性基團(tuán)嵌入后選擇性的不同,對(duì)一些極性物質(zhì)測(cè)定選擇性方面有了很大改善.對(duì)七種三嗪類農(nóng)藥的分離,(a)是用極性基團(tuán)嵌入的烷基固定相測(cè)定的譜圖,分離度極良好,峰形也十分對(duì)稱。而（b）是用普通烷基固定相測(cè)得的譜圖，選擇性很差，沒有分開。4.選用比C18鏈還要更長的烷基鏈做固定相前面討論過有些極性強(qiáng)的物質(zhì)，即便在有機(jī)相比例小于5%的流動(dòng)相下，在C18柱上也沒有分離所需要的足夠保留。通過增強(qiáng)固定相的疏水性來增加保留能力，對(duì)極性物質(zhì)來說，也是有效的，因?yàn)榧幢闶菢O性物質(zhì)也存在一定的疏水部位，極性物質(zhì)的疏水部位可以和固定相發(fā)生疏水相互作用而產(chǎn)生保留。所以，C27到C30的烷基作固定相，比普通高密鍵合的C

16、18固定相和極性基團(tuán)嵌入的C18固定相，無論分析非極性和極性物質(zhì)，一般其保留能力都更強(qiáng)，而且p H穩(wěn)定性也好很多。意想不到的是，超長鏈烷基固定相在高水流動(dòng)相下，抗相塌陷的能力也比C18固定相強(qiáng)，這與固定相的形態(tài)隨溫度的變化有關(guān)。C18鏈上起主要作用的C18H38基團(tuán)的熔點(diǎn)是29-30攝氏度，而C30H62的熔點(diǎn)是68-69攝氏度。C30鏈在普通液相的30-40度操作溫度下呈固態(tài)，因而不容易在高水流動(dòng)相下發(fā)生移動(dòng)和相塌陷。C18鏈處于液態(tài)狀態(tài)，這種情況下易移動(dòng)和發(fā)生相塌陷。上面是假設(shè)固定相類似處于液態(tài)烴的狀態(tài)，但固態(tài)的核磁共振對(duì)C30固定相測(cè)試的結(jié)果表明：隨著溫度的增加，C30鏈的可移動(dòng)性也會(huì)增

17、加，會(huì)增加紐結(jié)和彎曲的程度。圖六是用C30柱在100%水緩沖鹽流動(dòng)相測(cè)定各類核苷酸的圖譜，各個(gè)峰形非常的對(duì)稱，并長時(shí)間穩(wěn)定不發(fā)生保留能力逐步損失的現(xiàn)象；而用C18柱在同樣情況下測(cè)定，35個(gè)小時(shí)后保留能力就完全喪失了。5.選用孔徑更大的硅膠做填料基質(zhì)孔徑變大，按照LapLace-Young方程P=4COS/d，d變大，P就相應(yīng)變小，高水流動(dòng)相進(jìn)入孔內(nèi)所需要的壓力就小了，再加上鍵合相鍵合得不那么致密，就不容易發(fā)生相塌陷現(xiàn)象。但是孔徑大了，硅膠的比表面積就小了，保留能力就要大打折扣了。所以這種方法用得不多。五、增強(qiáng)極性和強(qiáng)極性物質(zhì)保留能力的幾種方法在使用反相色譜分析某些極性物質(zhì)時(shí),如果出峰時(shí)間接近死

18、時(shí)間t0,沒有保留或保留極小,要取得色譜分析和分離的結(jié)果,就需要調(diào)整或建立新的色譜方法以解決這種極性分析物的保留能力過弱問題。下面是解決這個(gè)問題的一般考慮方法和步驟：1調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH有一個(gè)普遍采用的初步探查合適色譜條件的方法：走一下梯度。譬如在一根4.6x150mm，5um，C18或者C8色譜柱上試著運(yùn)行20分鐘的乙腈水比例變化5-100%的梯度。但這僅對(duì)非極性的分析物適合，對(duì)酸性和堿性分析物，為了取得重現(xiàn)性好的結(jié)果，還必須在水相中加緩沖鹽。極性物質(zhì)很少是中性的，大多數(shù)藥物分子均屬于極性物質(zhì)，易于離子化。所以建立一種極性物質(zhì)的色譜分析條件，最好先走水相是低pH的梯度探查方法。低pH條件可以抑制

19、酸性物質(zhì)的電離，使分析物處于中性狀態(tài)更容易在反相色譜中得到保留。一般選用0.1%的三氟醋酸或者0.1%的甲酸溶液替代純水做梯度就可以。另外一個(gè)方案是用10-20mM的磷酸鹽調(diào)節(jié)pH到2.5。如果這樣調(diào)節(jié)到低pH就已經(jīng)取得了合適的保留，下一步就只需要優(yōu)化流動(dòng)相中水相的比例就可以取得滿意的結(jié)果。又如果低pH條件不奏效，分析物就可能是處于堿性狀態(tài)。對(duì)于堿性物質(zhì)，有效抑制離子化的辦法是使流動(dòng)相的pH大于堿性物質(zhì)pKa2個(gè)單位。對(duì)有些物質(zhì)，就要求流動(dòng)相的pH就要大于9，甚至要11以上。一般的硅膠色譜柱不能承受，就需要選用像月旭公司的Xtimate超限柱這樣的耐高pH的色譜柱進(jìn)行方法開發(fā)。高pH下。一般選用甘氨酸鹽等有機(jī)緩沖鹽比較合適，磷酸鹽在堿性條件下對(duì)硅膠基體的損害相對(duì)較大。幸運(yùn)的話，通過調(diào)節(jié)pH至合適的酸度或堿度，你就能找到合適的色譜方法來保留強(qiáng)極性物質(zhì)。如果還不能如愿，就需要另辟蹊徑了。2.選用一款保留能力更強(qiáng)的色譜柱一般載碳量越大，保留能力越強(qiáng)。在反相色譜條件下，即使對(duì)極性物質(zhì)，一般總是C18的保留能力比C8強(qiáng)；不同品牌的色譜柱，雖然同樣是C18固定相，但由于硅膠表面鍵合密度不同，載碳量會(huì)有很大的差別。3.離子對(duì)試劑當(dāng)你用100%的水或緩沖鹽流動(dòng)相,在耐水、耐堿或耐酸的保留能力已經(jīng)很強(qiáng)的柱子上仍得不到足夠的保留時(shí)，離