1、實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸 課件模板-3,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,（一）固定 為了更好的保持細(xì)胞和組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織自溶，有必要對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行固定。固定的作用不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，更重要的是最大限度的保存細(xì)胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬苄钥乖?，防止抗原彌散?不同抗原，其穩(wěn)定性也不相同，因而對(duì)固定劑的耐受性差異較大。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,如T淋巴細(xì)胞表面抗原屬不穩(wěn)定性抗原，對(duì)固定劑的耐受較差，抗原活性容易喪失。而HBsAg屬穩(wěn)定性抗原，其抗原活性很少受固定

2、劑種類、固定時(shí)間、溫度等因素的影響。 （二）固定劑 用于免疫組織化學(xué)的固定劑種類較多，性能各異，在固定半穩(wěn)定性抗原時(shí)，尤其重視固定劑的選擇，介紹如下。 1。醛類固定劑雙功能交聯(lián)劑，其作用是使組織之間相互交聯(lián)，保存抗原于原位，其特點(diǎn)是對(duì)組織穿透性強(qiáng)，收縮性小。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,有人認(rèn)為它對(duì)IgM、IgA、J鏈、K鏈和鏈的標(biāo)記效果良好，背景清晰，是常用的固定劑。 （1）10%鈣-福爾馬林液（濃甲醛10ml，飽和碳酸鈣90ml）。 （2）10%中性緩沖福爾馬林液（濃甲醋10ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml）。 （3）4%多聚甲醛

3、磷酸緩沖液pH7.4（多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml，兩者混 合加熱至60，攪拌并滴加1nNaOH至清晰為止，冷卻后加PBS液至總量1000ml）。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,（4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，濃甲醛10ml，蒸餾水加至100ml）。 戊二醛是二醛基化合物，交聯(lián)結(jié)合力比甲醛大，Bullock認(rèn)為交聯(lián)過強(qiáng)，可出現(xiàn)組織改變和空間遮蔽現(xiàn)象，影響組織的抗原性。但McDonald等認(rèn)為，該試劑用于PAP法免疫酶標(biāo)記效果仍滿意。 （5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞

4、和組織的固定：,濃甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸鈉1.25g,蒸餾水90ml）。 有人認(rèn)為此固定液懸液是較理想的固定液，標(biāo)記IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。也有人認(rèn)為它減弱細(xì)胞的抗原性，上皮細(xì)胞可產(chǎn)生非特異性熒光，故不宜用于免疫熒光標(biāo)記。氯化汞是一種強(qiáng)蛋白凝固劑，但對(duì)組織穿透性弱，且使組織收縮，故與甲醛混合使用。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,（6）醋酸-甲醛液（濃甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理鹽水加至100ml）。 Bullock等認(rèn)為此液固定效果良好，組織可不經(jīng)消化，胞漿IgA、IgG、IgM、IgD和K、J鏈標(biāo)記均呈陽性，且背景染色極淡。如標(biāo)記

5、IgG用PAP法第一抗體僅為甲醛升汞液的1/10。此液內(nèi)醋酸既可防止組織收縮，又可暴露胞漿免疫球蛋白抗原決定簇。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,（7）Bouins液。 該固定液為組織學(xué)、病理學(xué)常用固定劑之一，對(duì)組織穿透力較強(qiáng)而收縮性較小，比單獨(dú)醛類固定更適合免疫組化染色。Kayhko認(rèn)為用于標(biāo)記B細(xì)胞的J鏈較好，但Bullock則認(rèn)為它可導(dǎo)致Igg 重鏈變性，故必需加大第一抗體的濃度。 （8）Zambonis液。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,該固定液可用于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，對(duì)超微結(jié)構(gòu)的保存優(yōu)于純甲醛，也適用于光鏡免疫細(xì)胞

6、化學(xué)研究。采用2.5%多聚甲醛和30%飽和苦味酸，更可增加對(duì)組織穿透力和固定效果，以保存更多的組織抗原。固定時(shí)間6-18h。 （9）PLP液（過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液）。 該固定劑適用于富含糖類的組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,其機(jī)制是過碘酸氧化組織中的糖類形成醛基，通過賴氨酸的雙價(jià)氧基與醛基結(jié)合，從而與糖形成交聯(lián)。組織抗原大多數(shù)是由蛋白質(zhì)和糖兩部分構(gòu)成，抗原決定簇位于蛋白部分，故該固定液有選擇性地使糖類固定，既穩(wěn)定缺的，又不影響其在組織中的位置（固定劑7-9配制法見附錄1）。 2。非醛類固定劑Pe等人比較

7、幾種非醛類雙功能試劑指出，碳化二亞胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亞胺、和對(duì)苯醌等均適用于多肽類激素的組織固定，單獨(dú)使用時(shí)，邊緣固定效應(yīng)重，但與戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明顯改善。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,（1）碳化二亞胺（1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)cardodiimi-HCI）液：2g溶于100ml0.01mol/L,pH7.4PBS中。此液宜用于標(biāo)記多肽類激素的組織，對(duì)標(biāo)記IgA、IgG效果不佳。 （2）碳二亞胺-戊二醛液（ECD-G液）：配制法見附錄一。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和

8、組織的固定：,ECD-1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimideHydrochloride,即乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽，簡稱乙基-CDI。 該液常用于多肽類激素的固定，對(duì)酶等蛋白質(zhì)固定效果良好，對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原定位，超微結(jié)構(gòu)保存好，是一種培養(yǎng)細(xì)胞電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究的良好固定劑。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,（3）Zenkers 液（重鉻酸鉀2.5g,氯化汞5g,硫酸鈉1g,蒸餾水100ml,混合溶解后，臨用時(shí)加水醋酸5ml）。 該固定液對(duì)免疫球蛋白染色最佳，固定時(shí)間約2-4h，染色前必須脫汞色素。 3。

9、丙酮及醇類固定劑系最初免疫細(xì)胞化學(xué)染色的固定劑，其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，對(duì)組織穿透性很強(qiáng)，保存抗原的免疫活性較好。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,但醇類對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，解決的辦法是和其它試劑混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 （1）Clarke氏改良劑（100%酒精95ml，冰醋酸5ml），用于冰凍切片的后固定。 （2）乙醚（或氯仿）與乙醇等量混合液。 Danos（1976）等認(rèn)為其組織穿透性極強(qiáng)，即使涂片上富于過多的粘液，固定效果仍然良好，是理想的細(xì)胞固定液。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織

10、的固定：,（3）AAF液：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml。 （4）Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存?zhèn)溆谩?（5）Methacarn氏液：甲醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存?zhèn)溆谩?以上兩種固定液適宜某些抗原，癌基因蛋白產(chǎn)物檢測(cè)的 固定，P53抗癌基因蛋白產(chǎn)物，PC-NA等抗原的保存。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,丙酮的組織穿透性和脫水性更強(qiáng)，常用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的后固定，保存抗原性較好，平時(shí)4。C低溫保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)，只需將涂片或冰凍切片插入冷丙酮

11、內(nèi)5-10min，取出后自然干燥，貯存于低溫冰箱備用。 以上介紹了免疫組織化學(xué)中常用的固定液，用于免疫組化的固定劑種類很多（見附錄），不同的抗原和標(biāo)本需經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，選用最佳固定液。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,不少學(xué)者認(rèn)為，迄今尚無一種標(biāo)準(zhǔn)固定液可以用于各種不同的抗原固定。而且同一固定液固定的組織，免疫組化染色標(biāo)記結(jié)果可截然不同，致使人們無所適從。選擇最佳固定液標(biāo)準(zhǔn)是：最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定液在免疫組化技術(shù)中是禁用的。實(shí)際經(jīng)驗(yàn)告訴我們，中性緩沖福爾馬林（或多聚甲醛）是適應(yīng)性較廣泛的固定液，但固定時(shí)

12、間不宜過長。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,必要時(shí)，可作多種固定液對(duì)比，從而選出理想的標(biāo)準(zhǔn)固定液。 固定組織時(shí)應(yīng)注意：應(yīng)力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。組織塊不易過大過厚，必須小于2cm1.5cm0.3cm，尤其是組織塊厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)。固定液必須有足夠的量，在體積上一般大于組織20倍以上，否則組織中心固定不良影響效果。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,組織固定后應(yīng)充分水洗，去除固定液造成的人為假象。 （三）固定方法 1。浸入法（Immersionmethod）將組織浸泡在固定液內(nèi)，必要時(shí)可在低溫（4

13、。C）環(huán)境下進(jìn)行，固定時(shí)間可根據(jù)抗原的穩(wěn)定性以及固定液性質(zhì)而定，一般在2-12h之間。 2。灌注法（Irrigationmethod）此法適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,自左心室插入主動(dòng)脈，先以krebs或生理鹽水沖冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。置灌注動(dòng)物于4。C冰箱內(nèi)，次日取出腦組織或其它組織。外周組織一般在灌注后30min內(nèi)取材，取組織置同一固定劑中浸入1-3h，然后修整組織塊。有主張用冷固定劑（4。C）進(jìn)行灌注。我們的體會(huì)是一般光鏡下觀察的標(biāo)本，室溫固定即可獲滿意效果。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：二、細(xì)胞和組織的

14、固定,二、細(xì)胞和組織的固定：,應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，保持組織新鮮是很重要的，據(jù)報(bào)告，肽類抗原活性在斷絕血液供應(yīng)后24h幾乎完全喪失。 灌注法固定可使固定液迅速達(dá)到全身各組織。達(dá)到充分固定之目的。灌注沖洗還能排除紅細(xì)胞內(nèi)假過氧化物酶的干擾。浸入法主要用于活檢和手術(shù)標(biāo)本，以及其它不能進(jìn)行灌注的組織固定。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,應(yīng)用于光鏡的免疫組織化學(xué)染色的切片厚度一般要求5m左右，神經(jīng)組織的研究要求切片厚度在20-100m，有利于追蹤神經(jīng)纖維的走行。 1。冰凍切片 是免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗

15、原更應(yīng)采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,冰凍時(shí)，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。一般認(rèn)為冰晶少而大時(shí)，影響較小，冰晶小而多時(shí)，對(duì)組織結(jié)構(gòu)損害較大，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長速率成正比，而與成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對(duì)組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴(yán)重。因此，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,Fish認(rèn)為冰凍開始時(shí)，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C,從-30。C降至-43。C之間，成核率急劇增加達(dá)10

16、18，然后再減慢?；谏鲜隼碚摽刹扇∫韵麓胧p少冰晶的形成。 （1）速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。C43。C的時(shí)間，減少冰晶的形成。其方法有二： 干冰-丙酮（酒精）法：將150-200ml丙酮（酒精）裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時(shí)，溫度可達(dá)-70C，用一小燒杯（50-100ml）內(nèi)裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮（純酒精）飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達(dá)-70時(shí)即可使用。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,將組織（大小為1cm0.8cm0.5cm）投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80低溫冰箱內(nèi)

17、貯存。 液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,取出組織冰塊立即置入-80冰箱貯存?zhèn)溆?，或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。 （2）將組織置于20%-30%蔗糖溶液13天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。 影響冰凍切片的因素較多，因此，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機(jī)是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。目前冰凍切片機(jī)有兩類： 恒慢冰凍切片機(jī)（Cry

18、astat）：為較理想的冰凍切片機(jī)，型號(hào)很多，但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于-30C低溫密閉室內(nèi)，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4m，完全能滿足免疫組織化學(xué)標(biāo)記要求。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-1518為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng)。 開放式冰凍切片機(jī)：包括半導(dǎo)體致冷切片機(jī)和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機(jī)。切片時(shí)暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術(shù)難度大，在高溫季節(jié)，切片更加困難，且切片厚815m，不易連續(xù)切片，但其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉，國內(nèi)有生產(chǎn)。,實(shí)用免疫細(xì)胞

19、與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,冰凍切片后如不染色，必須吹干，貯存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存冰箱保存。 2。石蠟切片 其優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：脫水、透明等過程應(yīng)在4。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,C下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失。組織塊大小應(yīng)限于2cm1.5cm0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸蠟。浸蠟、包埋過程中，石蠟應(yīng)保持在60以下，以溶點(diǎn)低的軟蠟最好（即低溫石蠟包埋）。 組織塊脫水、透明、浸蠟時(shí)間參考表

20、1-3： 表 1-3 組織塊處理時(shí)間表 170%乙醇434h280%乙醇434h390%乙醇423h495%乙醇423h595%乙醇412h6100%乙醇41.5h7100%乙醇41.5h8二甲苯40.51h9二甲苯40.51h10石蠟601h11石蠟602h 以上全過程為18-24h，也可在室溫內(nèi)使用自動(dòng)脫水機(jī)代替。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,如組織塊小，直徑小于0.5cm，可用快速石蠟包埋切片，全過程只需4h左右。 石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度27m，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。由于甲醛固定、有機(jī)熔劑和包埋劑對(duì)組抗原有

21、一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變。有人報(bào)告經(jīng)蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強(qiáng)度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,石蠟切片應(yīng)入37恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，可存放于4冰箱內(nèi)備用。 石蠟切片優(yōu)點(diǎn)較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機(jī)溶劑處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法（Freeze drying embedding methed），可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片

22、技術(shù)：,該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機(jī)（Freezing dryer）在真空、低溫條件下排除組織內(nèi)水分 ，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織，最后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標(biāo)記、免疫酶標(biāo)記及放射自顯影。 3。振動(dòng)切片 用振動(dòng)切片機(jī)（Vibratotme），可以把新鮮組織（不固定不冰凍）切成厚片20100m，以漂浮法在反應(yīng)板進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應(yīng)陽性部位，修整組織進(jìn)行后固定，最后按電鏡樣品制備、脫水、包埋、超薄切片、染色觀察等。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,組織不冰凍，無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了

23、組織脫水、透明、包埋等步驟對(duì)抗原的損害，能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原，主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布研究。這種包埋前染色，尤其實(shí)用于免疫電鏡觀察。 4。塑料切片 塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類（Glycolmethacrylate, GMA）及環(huán)氧樹脂類（Epon 812,618），其優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)作光鏡和電鏡檢測(cè)，能相互對(duì)照所查抗原，定位準(zhǔn)確。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,塑料包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片，光鏡切片可薄至0.52um，故稱半薄切片（Semithinsection）。GMA保存抗原較好，不與組織產(chǎn)生共聚合，但形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)欠佳。

24、環(huán)氧樹脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，但在聚合過程中易和組織起作用，改變抗原結(jié)構(gòu)。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,塑料包埋切片由于處理程序繁多，抗原活性易丟失。同時(shí)半薄切片進(jìn)行免疫染色時(shí)，抗血清不易穿透樹脂，因此，塑料切片主要用于免疫電鏡的超微切片前定位。包埋前染色的標(biāo)本，切片薄切片后不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)部位呈黑點(diǎn)狀，定位后進(jìn)一步作超薄切片，這樣，可以明顯提高免疫電鏡陽性檢出率。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,5。超薄切片 電鏡標(biāo)本制作見第七章，應(yīng)用超薄切片機(jī)（Ultrotome）進(jìn)行切片。 6。

25、碳蠟切片 碳蠟（Carbowax），學(xué)名聚乙烯二醇（Polyethlene glycol, PEG）為水溶性蠟。根據(jù)其分子量不同，碳蠟有多種，如400、800、1000、1500、4000、6000等，用于組織包埋的有1500、4000兩種，其熔點(diǎn)分別38C和52。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,C左右，常溫下為固體石蠟狀，加溫熔化呈液體狀。 本法的特點(diǎn)是組織固定水洗后，不需脫水透明可直接浸蠟包埋，且切片方法與常規(guī)石蠟切片相同。切下的組織片漂浮水面后自然展開，碳虹迅速深化，組織片即可展平，制片過程簡單易行。 具體操作簡述如下：組織塊不宜過大，一般限定在1.5cm1cm0.1cm以內(nèi)。,實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸：三、組織切片技術(shù),三、組織切片技術(shù)：,組織固定后充分水洗去除固定液，用濾紙吸干組織表面水。將組織浸入碳蠟（1500）內(nèi)，4530min。再次浸入混合混合碳蠟液（1500和4000等量混合液），5230min。浸入等量混合碳蠟液（或根據(jù)氣溫、濕度變化調(diào)整4000和5000混合比例，如氣溫高濕度大可以400