1、細(xì)菌檢驗自動化技術(shù)的應(yīng)用,學(xué)習(xí)目的與要求,熟悉微生物數(shù)碼鑒定的原理和方法。 2. 了解半自動化、全自動微生物鑒定和藥敏試驗分析系統(tǒng)的基本原理和步驟 3. 了解自動化血液細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)的工作原理,細(xì)菌鑒定的技術(shù)近十幾年得到了快速發(fā)展，從人工鑒定到自動化技術(shù)，細(xì)菌鑒定技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了以下發(fā)展歷程：,人工鑒定,培養(yǎng)基的微量化、標(biāo)準(zhǔn)化和商品化,數(shù)碼分類鑒定技術(shù)（生化反應(yīng)的數(shù)字化）,自動化鑒定技術(shù)（生物信息的電腦化）,使細(xì)菌的鑒定和藥敏試驗都實現(xiàn)了自動化。,一、微生物數(shù)碼鑒定法 早在七十年代中期，一些國外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細(xì)菌的新方法。這些技術(shù)的應(yīng)用，為醫(yī)學(xué)微生物檢驗工作提供了一個簡便、科學(xué)

2、的細(xì)菌鑒定程序，大大提高了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。 目前，微生物編碼鑒定技術(shù)已經(jīng)得到普遍應(yīng)用，并早已商品化和形成獨特的不同細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系統(tǒng)。這種鑒定系統(tǒng)是自動化鑒定系統(tǒng)的基礎(chǔ)。,數(shù)碼鑒定 是指通過數(shù)學(xué)的編碼技術(shù)將細(xì)菌的生化反應(yīng)模式轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)模式，給每種細(xì)菌的反應(yīng)模式賦予一組數(shù)碼， 建立數(shù)據(jù)庫或編成檢索本。 通過對未知菌進(jìn)行有關(guān)生化試驗并將生化反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字（編碼），查閱檢索本或數(shù)據(jù)庫，得到細(xì)菌名稱。 其基本原理是計算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個細(xì)菌條目對系統(tǒng)中每個生化反應(yīng)出現(xiàn)的頻率總和。,(一)數(shù)碼鑒定法基本原理,微量生化反應(yīng)

3、系統(tǒng),Micro-ID系統(tǒng), + + + + + + + ,0 2 0 0 2 1 4 0 0 0 2 1 4 0 0,2 3 4 3 4,相加所得數(shù)字：23434 查出相應(yīng)細(xì)菌為：大腸埃希菌,先將細(xì)菌分離純化。 做一個革蘭染色。 根據(jù)染色結(jié)果選擇不同的生化反應(yīng)板進(jìn)行接種（同一個鑒定系統(tǒng)，配有不同細(xì)菌的生化反應(yīng)板）。 培養(yǎng)后，讀取生化反應(yīng)結(jié)果，得到一組數(shù)據(jù)。 將這組數(shù)據(jù)查編碼本（即數(shù)據(jù)庫），即得到鑒定結(jié)果。,（二）鑒定步驟：,國內(nèi)的： 有河南開封醫(yī)學(xué)生物研究所的腸桿菌科細(xì)菌鑒定卡E-15； 上海市衛(wèi)生防疫站的發(fā)酵性革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)SWF-A；,二、自動化的微生物鑒定和 藥敏試驗分析系統(tǒng),

4、細(xì)菌數(shù)碼分類技術(shù)是細(xì)菌自動化鑒定技術(shù)的基礎(chǔ)，細(xì)菌鑒定自動化是把生化反應(yīng)數(shù)字化技術(shù)進(jìn)一步電腦化，數(shù)據(jù)庫用電腦管理，結(jié)果用電腦分析和鑒定。,鑒定系統(tǒng)的工作原理因不同的儀器和系統(tǒng)而異。不同的細(xì)菌對底物的反應(yīng)不同是生化反應(yīng)鑒定細(xì)菌的基礎(chǔ)，而試驗結(jié)果的準(zhǔn)確度取決于鑒定系統(tǒng)配套培養(yǎng)基的制備方法、培養(yǎng)物濃度、孵育條件和結(jié)果判定等。 大多鑒定系統(tǒng)采用細(xì)菌分解底物后反應(yīng)液中pH的變化，色原性或熒光原性底物的酶解，測定揮發(fā)或不揮發(fā)酸，或識別是否生長等方法來分析鑒定細(xì)菌。,1VITEK-ATB半自動細(xì)菌鑒定和藥敏分析系統(tǒng) VITEK-ATB是生物-梅里埃公司產(chǎn)品。 由計算機和讀數(shù)器兩部分組成，計算機程序包括ATB和

5、API的鑒定數(shù)據(jù)庫、ATB的藥敏數(shù)據(jù)庫、數(shù)據(jù)儲存和分析系統(tǒng)及藥敏專家系統(tǒng)。 鑒定和藥敏反應(yīng)板在機外孵育后，一次性上機讀取結(jié)果，由計算機進(jìn)行分析和處理，并報告細(xì)菌鑒定和藥敏結(jié)果。,(一)半自動化細(xì)菌鑒定和藥敏分析系統(tǒng),2AutoScan-4半自動細(xì)菌鑒定和藥敏分析系統(tǒng) AutoScan-4是由Dade MicroScan公司(美國)生產(chǎn)。 由計算機和讀數(shù)器兩部分組成。鑒定和藥敏反應(yīng)板在機外孵育后，一次性上機，自動判讀鑒定和藥敏試驗結(jié)果；亦可人工進(jìn)行判讀，將編碼輸入計算機，由計算機軟件評定結(jié)果。有鑒定及鑒定藥敏復(fù)合板兩種測試卡。,（二） 全自動的微生物鑒定和 藥敏試驗分析系統(tǒng),1VITEK 系統(tǒng)

6、VITEK AMS是由生物-梅里埃公司生產(chǎn)。第一代產(chǎn)品有以下四個規(guī)格VITEK AMS 32、60、120、240。 系統(tǒng)結(jié)構(gòu) 由計算機主機、 孵育箱/讀取器、 充填機/封口機、 打印機等組成。,鑒定原理 是采用光電比色法，根據(jù)不同微生物的理化性質(zhì)不同，測定微生物分解底物導(dǎo)致pH改變而產(chǎn)生的不同顏色，來判斷反應(yīng)的結(jié)果。 每張卡上有30項生化反應(yīng)。由計算機控制的讀數(shù)器，每隔1h對各反應(yīng)孔底物進(jìn)行光掃描，并讀數(shù)一次，動態(tài)觀察反應(yīng)變化。一旦鑒定卡內(nèi)的終點指示孔到臨界值，則指示此卡已完成。系統(tǒng)最后一次讀數(shù)后，將所得的生物數(shù)碼與菌種數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)菌的生物模型相比較，得到相似系統(tǒng)鑒定值，并自動打印出實驗報告。

7、,使用方法 獲得細(xì)菌的純培養(yǎng)后，調(diào)整菌懸液濃度 根據(jù)不同的細(xì)菌選擇相應(yīng)的藥敏試驗卡片，在充液倉中對卡片進(jìn)行充液。 置孵育箱讀數(shù)器中孵育，自動定時測試、讀取數(shù)據(jù)和判斷結(jié)果。 鑒定范圍 VITEK可快速鑒定包括各種腸桿菌科細(xì)菌、非發(fā)酵細(xì)菌、苛氧菌、革蘭陽性球菌、革蘭陰性球菌、厭氧菌和酵母菌等500種臨床病原菌。 具有20多種藥敏測試卡、97種抗生素和測定超廣譜-內(nèi)酰胺酶測試卡，快速檢測細(xì)菌藥敏情況。,VITEK-2是生物-梅里埃公司開發(fā)的新一代微生物分析儀，其工作原理與VITEK AMS沒有大的差別，但它的容量更大，自動化程度更高，并且使用64孔的反應(yīng)卡片，鑒定更準(zhǔn)確可靠，可同時測定20種抗生素的

8、藥敏試驗。,系統(tǒng)構(gòu)成 由主機、真空加樣器、孵育箱/讀取器、計算機、打印機等組成。 工作原理 除采用傳統(tǒng)呈色反應(yīng)法外，同時采用敏感度極高的快速熒光測定技術(shù)來檢測細(xì)菌胞外酶。 鑒定板有普通板和快速板兩種，普通板獲得結(jié)果需要16-18h，快速板測定只需2-3.5h。,2. MicroScan Walk/ Away系統(tǒng),此系統(tǒng)有walk/Away-40和96兩個型號，40或96分別代表該系統(tǒng)可同時容納40或96個測試板。 該系統(tǒng)有8種鑒定反應(yīng)板，可鑒定包括革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、厭氧菌、酵母菌、嗜血桿菌和奈瑟菌等近800種細(xì)菌。藥敏部分采用比濁法進(jìn)行測定，90菌株可在5.5h內(nèi)獲得對1733種抗菌藥物

9、的MIC值。,1自動化鑒定系統(tǒng)是根據(jù)數(shù)據(jù)庫中所提供的背景資料鑒定細(xì)菌，數(shù)據(jù)庫資料的不完整將直接影響鑒定的準(zhǔn)確性。目前為止，尚無一個鑒定系統(tǒng)能包括所有的細(xì)菌鑒定資料。對細(xì)菌的分類是根據(jù)傳統(tǒng)的分類方法，因此鑒定也以傳統(tǒng)的手工鑒定方法為“金標(biāo)準(zhǔn)”。使用自動化鑒定儀的實驗室，應(yīng)對技術(shù)人員進(jìn)行手工鑒定基礎(chǔ)與操作技能培訓(xùn)。,(三)使用自動化鑒定儀的局限性,2隨著人們對細(xì)菌本質(zhì)認(rèn)識的加深而不斷演變，使用自動化鑒定儀的實驗室應(yīng)經(jīng)常與生產(chǎn)廠家聯(lián)系 ，及時更新數(shù)據(jù)庫。實驗室技術(shù)人員應(yīng)了解細(xì)菌分類的最新變化，便于在系統(tǒng)更新之前即可進(jìn)行手工修改。 3通過自動化鑒定儀得出的結(jié)果，必須與其它已獲得的生物性狀（如標(biāo)本來源、

10、菌落特征及其它的生理生化特征）進(jìn)行核對，以避免錯誤的鑒定。,藥敏試驗分析系統(tǒng) 基本原理 是將抗生素微量稀釋在條孔或條板中，加入菌懸液孵育后放入儀器或在儀器中直接孵育，通過測定細(xì)菌生長的濁度，或測定培養(yǎng)基中熒光指示劑的強度或熒光原性物質(zhì)的水解，觀察細(xì)菌的生長情況。在含有抗生素的培養(yǎng)基中，濁度的增加提示細(xì)菌生長，根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)解釋敏感或耐藥。,三、自動化的血液細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng) 正常血液是無菌的，細(xì)菌侵入可導(dǎo)致菌血癥、敗血癥、膿毒血癥，及時準(zhǔn)確地進(jìn)行病原學(xué)診斷極為重要。傳統(tǒng)的血培養(yǎng)是抽取5ml血液注入血培養(yǎng)瓶中，放入孵箱，每天觀察結(jié)果，費時費力，不能及時發(fā)陽性結(jié)果，易延誤診斷。 全自動血液細(xì)菌培養(yǎng)儀主要優(yōu)

11、點是可以在較短培養(yǎng)時間內(nèi)提示出血液培養(yǎng)瓶中有無微生物的存在。,1BACTEC系列 BACTEC460、NR-730是早期的血液培養(yǎng)儀，目前基本上已被BACTEC9000系列替代（包括9050、9120和9240三種型號，可分別容納50、120和240個培養(yǎng)瓶）。 微生物在生長過程中消耗培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生的二氧化碳直接激活瓶底部預(yù)埋的對二氧化碳濃度變化高度敏感的熒光物質(zhì)，在激發(fā)光的激發(fā)下放出熒光，熒光的強度變化直接反映瓶內(nèi)二氧化碳濃度變化，來判斷瓶內(nèi)有無微生物生長。 根據(jù)不同的培養(yǎng)要求，該系統(tǒng)配置了標(biāo)準(zhǔn)需氧厭氧培養(yǎng)瓶、有中和抗菌藥物的樹脂培養(yǎng)瓶、厭氧菌和真菌等多種培養(yǎng)瓶。,2BacTAlert系統(tǒng) 該系統(tǒng)有BacTAlert48、72、96、120、240及3D等型號。 測定原理 當(dāng)培養(yǎng)瓶內(nèi)有微生物生長，代謝過程中產(chǎn)生的二氧化碳可經(jīng)過半透膜滲透至瓶底，與固定于瓶底的NovelCO2感應(yīng)器結(jié)合，產(chǎn)生顏色變化，通過光電檢測得知二氧化碳變化情況。通過計算機處理后，在曲線圖上反映、分析、判斷陰性或陽性結(jié)果，并及時報警。 系統(tǒng)配置有需氧培養(yǎng)瓶、厭氧培養(yǎng)瓶、中和抗生素需氧瓶、中和抗生素厭氧瓶、小兒培養(yǎng)瓶、血液分枝桿菌培養(yǎng)瓶和痰液分枝桿菌培養(yǎng),3. VITAL系統(tǒng) 測定原理 使用均質(zhì)熒光技術(shù)的快速培養(yǎng)系