1、第六章 DNA重組的操作,基因工程,外源DNA,載體DNA,重組分子,連接,？,1.基因文庫 2.PCR 3.基因差異表達,第一節(jié) DNA的體外重組,限制酶 分子剪刀,限制酶 分子剪刀,連接酶 分子膠水,重組DNA分子,粘性末端連接效率最高！,黏性末端,黏性末端,1、粘性末端的連接,第一節(jié) DNA的體外重組,1. 粘性末端連接,創(chuàng)造互補粘性末端的方法有哪些？ 同種酶 同尾酶,第一節(jié) DNA的體外重組,（1）兩端具有相同粘末端的DNA分子之間的連接,第一節(jié) DNA的體外重組,堿性磷酸酶：去掉其5末端的磷酸基，以防質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化 。 注意： 目的基因正反向插入； 載體與多個目的基因片段重組。

2、,1,2,3,1,2,3,4,4,3,4,第一節(jié) DNA的體外重組,（2）兩端具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接,兩種不同的限制性內(nèi)切酶 兩端會產(chǎn)生非互補的突出端 定向重組體,第一節(jié) DNA的體外重組,質(zhì)粒載體的定向重組,堿性磷酸酶？,避免了目的基因正反向插入,2. 平頭末端連接,第一節(jié) DNA的體外重組,平末端平末端,SmaI限制酶,第一節(jié) DNA的體外重組,T4 DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5端與3端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。,（1） 直接連接,第一節(jié) DNA的體外重組,（2） 人工加尾形成 “粘性末端” a）同聚加尾 法 DNA末端轉(zhuǎn)

3、移酶 DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3-OH端加上脫氧核苷酸, 利用DNA末端轉(zhuǎn)移酶分別給載體和插入片斷加上互補的核苷酸。,第一節(jié) DNA的體外重組,非酶切位點,a）同聚加尾法,缺點：不能把插入片段再切下來。,第一節(jié) DNA的體外重組,還有哪些方法能夠創(chuàng)造粘性末端？,第一節(jié) DNA的體外重組,b）銜接物(linker)連接 Linker:用化學合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點序列的平端雙鏈。,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoRI linker：,第一節(jié) DNA的體外重組,銜接物(linker)連接,第一節(jié) DNA的體外重組,銜接物(linker

4、)連接,優(yōu)點： 1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。 2）能給載體連接上Polylinker 缺點： 如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點，不能切下完整的插入片段,第一節(jié) DNA的體外重組,c) DNA接頭 (adapter)連接法 adapter:一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）。 adapter的作用:用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。,5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5,BamHI adapter,第一節(jié) DNA的體外重組,缺點：接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。 防止自我連接： 先用堿性磷酸酶（CIP）處理接頭 以后

5、再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。,DNA接頭 (adapter)連接法,平頭末端連接 （1） 直接連接 （2） 人工加尾形成 “粘性末端” a)同聚加尾法 b)銜接物連接 c) DNA接頭連接法,小結(jié),PCR?,第一節(jié) 重組DNA分子的構(gòu)建,3.PCR產(chǎn)物的連接 （1）在引物的5端設(shè)計酶切位點,GCAGAATTC,互補序列,3端1520bp與模板互補； 5端610bp是某個內(nèi)切酶的識別序列,（5端多余的35bp屬保護堿基）,引物,第一節(jié) DNA的體外重組,引物1,GCAGAATTC,互補序列,模板,EcoRI位點,5-,-3,GCAGAATTC,互補序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC

6、,互補序列 PCR產(chǎn)物,5-,-3,3,復性,延伸,模板,模板,3,第一節(jié) DNA的體外重組,GCTAGCCGG,互補序列,模板,BamH I 位點,-5,3-,復性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互補序列,3-,模板,GCTAGCCGG,PCR產(chǎn)物 互補序列,引物2,3,3,第一節(jié) DNA的體外重組,BamH I,EcoRI,質(zhì)粒載體的定向重組,PCR,第一節(jié) DNA的體外重組,（2）與T載體直接連接 Taq DNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3端再加上一個多余的核苷酸（優(yōu)先加A）,因此PCR產(chǎn)物兩個3端一般都有一個A T載體的兩個3端人為地各加一個T：利用Taq DNA聚合

7、酶，當原料中只有dTTP時，被迫在平端載體上添加T！,Taq DNA聚合酶,第一節(jié) DNA的體外重組,T載體圖,第一節(jié) DNA的體外重組,A,A,dNTP,T,T,dTTP,Taq DNA聚合酶,載體,PCR產(chǎn)物,T A,T A,3. PCR產(chǎn)物的連接 （2）與T載體直接連接,1. 粘性末端連接 （1）兩端具有相同粘末端的DNA分子之間的連接 （2）兩端具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接 2. 平頭末端連接 （1）直接連接 （2）人工加尾形成 “粘性末端” a)同聚加尾法 b)銜接物連接 c) DNA接頭連接法 3. PCR產(chǎn)物的連接 （1）在引物的5端設(shè)計酶切位點 （2）與T載體直接連接

8、,第一節(jié) DNA的體外重組,思考： 怎樣進行有效的 DNA體外連接？,第一節(jié) DNA的體外重組,二、DNA體外連接應注意的事項 1.插入片斷與載體的酶切位點互補 相同的粘性末端才能有效地連接。 盡量避免平端連接。,BamHI,BamHI,Sau3AI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個堿基的粘性末端。,第一節(jié) DNA的體外重組,2. 插入基因的開放閱讀框（ORF）正確 （1）DNA定向插入,由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。,雙酶切,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,第一節(jié) DNA的體外重組,（2）起始密碼 尤其當載體上有ATG起始密碼的時候，更要注意。,ATG G AA TTC,載體,ATG CGG AAT TCT,插入片斷,EcoRI,EcoRI,ATG G AAT TCT,重組,但移碼突變！,3. 防止載體自身環(huán)化連接 （1）提高插入片斷的用量 連接反應體系中，插入片斷比載體多10倍以上。 （2）用堿性磷酸酶處理載體 載體切口的5磷酸被除去，不能自我連接。,三、載體和外源DNA插入