1、,高中生物技術(shù)實(shí)踐課件,血紅蛋白的提取和分離,本課題學(xué)習(xí)目標(biāo),體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。 1、主要概念：凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。 2.主要原理：凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理 3、課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法 4、課題難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。,2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成，這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代,人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息,蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子

2、的總和。主要是對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究,2.提問(wèn)：血液有哪些成分？,1.提問(wèn)：用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？,雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提??；人的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。,血紅蛋白,每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)， 此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二 氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而 呈紅色。,血紅蛋白的特點(diǎn)：,1.分離生物大分子的基本思路：,選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。,2.蛋白質(zhì)分離和提取的原理：,根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度

3、、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同種類的蛋白質(zhì)。,一、血紅蛋白的提取和分離,3.高溫滅菌和酒精滅菌的結(jié)果：,使微生物的蛋白質(zhì)發(fā)生變性、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞。,（一） 凝膠色譜法（分配色譜法）,2.凝膠：,大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或 瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。,根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大 小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來(lái)進(jìn)行 分離。,1.概念：,3.凝膠色譜法的原理分子篩效應(yīng)：,當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢;而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)

4、部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。依據(jù)的特性是：蛋白質(zhì)分子量的大小。,4.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過(guò)程,凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過(guò)程的動(dòng)畫(huà)演示,（二）緩沖溶液,1.概念:,在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng) 酸或強(qiáng)堿的影響使原來(lái)溶液PH值基本保持不變的混 合溶液。,能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響， 維持PH基本不變。,2.作用:,3.緩沖溶液的配制:,通常由12 種緩沖劑溶解于水 中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。,4.提問(wèn)：在本課題中使用的緩沖液是:_ , 其目的是:,利用緩沖

5、液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證 血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科 學(xué)研究(活性),磷酸緩沖液,緩沖溶液的組成及分類,弱酸及其對(duì)應(yīng)的鹽：,弱堿及其對(duì)應(yīng)的鹽：,多元弱酸的酸式鹽及其對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽:,H2CO3NaHCO3 ；CH3COOHCH3COONa,NH3H2ONH4CL ; NH4OHNH4CL,NaHCO3Na2CO3 ；NaH2PO4Na2HPO4,緩沖溶液由足夠濃度的共軛酸堿對(duì)組成。其中，能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)堿的稱為共軛酸；能對(duì)抗外來(lái) 強(qiáng)酸的稱為共軛堿。這一共軛酸堿通常稱為緩沖對(duì)、緩沖劑或緩沖系。常見(jiàn)的緩沖對(duì)主要有如下 三種類型：,（三） 電泳：,1.概念：,帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)

6、生遷移的過(guò)程。,2.原理：,許多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,3.類型:,瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。,在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng),瓊脂糖凝膠電泳示意圖,聚丙稀酰胺凝膠電泳,1、在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙稀酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-

7、甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。,蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決 于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。 （SDS的作用）為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響， 可以在凝膠中加入SDS。,2.原理：,聚丙稀酰胺凝膠電泳,SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。,3. SDS作用機(jī)理:,用SDS測(cè)定蛋白

8、質(zhì)分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。,二、實(shí)驗(yàn)操作,樣品處理粗分離純化純度鑒定,1.樣品處理：,（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟,（二）操作過(guò)程,本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎 動(dòng)物的血液來(lái)分離血紅蛋白。,(1)紅細(xì)胞的洗滌:,洗滌目的:,去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的 分離純化，洗滌次數(shù)不可過(guò)少。,洗滌操作：,1、采集血樣。2、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越

9、長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時(shí)間）6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒(méi)有黃色，表明洗滌干凈。,(2)血紅蛋白的釋放：,加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。,(3)分離血紅蛋白溶液：,過(guò)程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層

10、（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。分離：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。,二、實(shí)驗(yàn)操作,甲苯層（無(wú)色透明）,白色薄層固體,紅色透明液體,雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）,試管中溶液層次,(4)透析：,過(guò)程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。,二、實(shí)驗(yàn)操作,透析過(guò)程動(dòng)畫(huà)演示,2.凝膠色譜操作:,（1）凝膠色譜柱的制作：,取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂

11、紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。,（2）凝膠色譜柱的裝填,凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。 凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 凝

12、膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。,洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。,（2）凝膠色譜柱的

13、裝填,50cm高,（3）樣品加入與洗脫,調(diào)節(jié)緩沖液面：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 樣品滲入凝膠床：加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功） 注意：正

14、確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。,（3）樣品加入與洗脫,注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。,思考下面的問(wèn)題：,讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。,1、在血紅蛋白的整個(gè)過(guò)程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？,2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？,血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。,3、你能描述血紅蛋白分離的完整過(guò)程嗎？,血

15、紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。,（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,2.試劑的配制：,鑒定血紅蛋白純度。,1.目的：,丙烯酰胺和N, N-甲叉雙丙烯酰胺: 用去離子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液。十二烷基硫酸鈉（SDS）: 用去離子水配成10%的貯存液，于室

16、溫保存。用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液。TEMED ：作用通過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。用去離子水配制10% 過(guò)硫酸銨：作用是提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。Tris甘氨酸電泳緩沖液：25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。樣品處理液： 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚藍(lán)，10%的甘油。染色液： 0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。脫

17、色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。,1、由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。 2、TEMED和過(guò)硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。 3、在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。,注意事項(xiàng)：,（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳, SDS-聚丙烯酰胺分離膠制備：用去離子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris緩沖液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的過(guò)硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均勻

18、，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長(zhǎng)再加0.5 cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高23 mm），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。分離膠聚合完全后（約30 min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。配制SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液用去離子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris緩沖液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的過(guò)硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液

19、，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。,（1）根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)安裝電泳用的玻璃板,（2）SDS聚丙烯酰胺凝膠制備：,3、電泳方法步驟,（3）樣品處理：在電泳樣品中按11體積比加入樣品處理液，在100 溫度下加熱3 min，以使蛋白質(zhì)變性。（4）濃縮膠聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。（5）加樣：按順序加樣，加樣量通常為1025 L。樣品可以多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后(即進(jìn)行凝膠色譜分離之前)的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品（6）電泳：將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8 V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15 V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1 cm處，關(guān)閉電源。（7）剝膠：從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開(kāi)玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位。（8）染色：將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1-2 h。（9）脫色：染色完畢，傾出染色液,換脫色液脫色3-10 h，其間需多次更換脫色液至背景清楚。（10）觀察結(jié)果：SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過(guò)程中，待別是樣品制備過(guò)程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。,3、電泳方法步驟,觀察你處理的血液樣