1、酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)人甲胎蛋白(AFP),酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA),ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù) 。 在臨床檢驗(yàn)中主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。,基本原理,它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。 在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物） 酶作用的底物（顯色

2、劑）,測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性； 然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性； 當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。 其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。 其方法簡(jiǎn)單，方便訊速，特異性強(qiáng)。,獲得待分析物的未標(biāo)定抗體,將特異性抗體與固相 載體連接形成固相抗體,洗滌除去未結(jié)合的 抗體及雜質(zhì),加入封閉蛋白溶液以封閉載體 表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn),洗滌并除去未

3、結(jié)合的封閉蛋白,加受檢標(biāo)本（抗原）形成 固相抗體抗原復(fù)合物,洗滌除去其他 未結(jié)合的物質(zhì),加酶標(biāo)抗體生成 抗體待測(cè)抗原酶標(biāo)記抗體 的復(fù)合物,徹底洗滌 未結(jié)合的 酶標(biāo)抗體,加底物進(jìn)行 酶催化反應(yīng),根據(jù)顏色反應(yīng)的 程度進(jìn)行該抗原 的定性或定量測(cè)定,雙抗體夾心法:適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,概述-甲胎蛋白AFP,一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來(lái)自胚胎的肝細(xì)胞，胎兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升。 在成人，AFP可以在大約80%的肝癌患者血清中升高，在生殖細(xì)胞腫瘤出現(xiàn)AFP陽(yáng)性率為50%。 在其它腸胃管腫瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出

4、現(xiàn)不同程度的升高。,目的： ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其他相關(guān)生物液體中甲胎蛋AFP的含量。掌握ELISA的工作原理、適用對(duì)象和操作方法。 實(shí)驗(yàn)原理：用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人AFP水平。 用純化的人AFP抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被單抗的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品，再與HRP標(biāo)記的AFP抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物； 經(jīng)過徹底洗滌后加底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色；TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色； 顏色的深淺和樣品中的AFP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人甲胎蛋白（A

5、FP）濃度。,試劑盒組成：,1.酶聯(lián)板：一塊（96孔） 2.標(biāo)準(zhǔn)品 3.HRP標(biāo)記的抗AFP抗體 4.TMB顯色 5.濃洗滌液 6.終止液,樣本處理及要求：,1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。 2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。 3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。,4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），收集上清。 5.細(xì)胞：用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞3次，調(diào)

6、整細(xì)胞濃度達(dá)到104-106/ml左右，通過反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份，或者細(xì)胞超聲粉碎，離心取上清液檢測(cè)。 6. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。1g組織加入9mlPBS（濃度為0.1M，pH為7.4的）,充分勻漿，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。,1.取出試劑盒，室溫放置30分鐘。 2.分組：取出96孔板，根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品組（5個(gè)濃度）、空白孔（1個(gè)）、待測(cè)樣品組（共12個(gè)）。 注：為減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證準(zhǔn)確性，建議設(shè)置復(fù)孔。 3.加樣：標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品。分別加入40ul。空白調(diào)零孔

7、：不加任何試劑。 注意不要有氣泡。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。 4.溫育：用封板膜封板后置37溫育35分鐘。 5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加300ul洗滌液，靜置1分鐘棄去，如此重復(fù)5次，拍干。,操作步驟,6.加酶標(biāo)溶液：標(biāo)準(zhǔn)品組、待測(cè)樣本組各孔中加入100ul的HRP標(biāo)記的抗AFP抗體，空白調(diào)零孔除外。37溫育35分鐘。 7.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加300ul洗滌液，靜置1分鐘棄去，如此重復(fù)5次，拍干。 8.顯色：各孔加入顯色劑A液50ul后，再加入顯色劑B液50ul。輕輕震蕩混勻，37避光顯色15分鐘. 9.終止：加入50ul

8、終止液。終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 10.讀板：以空白孔調(diào)零，在450nm波長(zhǎng)讀取各孔的OD值。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。,操作步驟,注意事項(xiàng),1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。 2.濃縮洗液可能會(huì)有結(jié)晶析出，在水浴中加溫助溶。 3.加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)。 4.請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)最后乘以總稀釋倍數(shù)（n5）。,計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)品的