1、常用生物軟件及使用概述,也許不必將它當成您的研究領(lǐng)域但您最好知道如何使用這個工具,一、管理實驗室數(shù)據(jù)及文獻資料,查閱實驗相關(guān)文獻,以便對自己所要做課題的最新進展有一個基本的了解，從而確定自己的實驗策略；同時，方便實驗室結(jié)果的儲存，管理和申報工作。常用軟件： 1、Reference Manager （可以在線通過查找關(guān)鍵詞搜索PubMed等多個數(shù)據(jù)庫中的專業(yè)資料,同時保存查找的資料為本地文件。 ） 2、 Endnote（一個在線專業(yè)資料查找系統(tǒng),可以保存查找資料,并在文章中對引用格式化. ） 3、醫(yī)學文獻王（特長在中文期刊的系統(tǒng)化，也支持外文文獻數(shù)據(jù)庫）,二、分析和處理實驗數(shù)據(jù)和公共數(shù)據(jù),隨著實

2、驗的進行，就必須對實驗過程中的DNA、RNA和蛋白質(zhì)的信息進行各種處理，包括限制酶分析、引物設(shè)計、同源序列比較、質(zhì)粒作圖、結(jié)構(gòu)域(motif)查找、RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、蛋白二級結(jié)構(gòu)分析、三維結(jié)構(gòu)顯示等方面的內(nèi)容。,1、限制酶分析,推薦軟件： DNAssist 1.0 大多軟件只對線性序列進行分析，那么cNNNNN NNNgaatt環(huán)狀的序列就找不到EcoR I的位點，DNAssist 1.0能很容易把這個EcoR I位點找出來。 另外DNAssist在輸出上非常完美，除了圖形、線性顯示外，還有類似DNASIS的列表方式，列出所有的位點（按酶排列，按堿基順序排列） 另外，Vector NTI 亦

3、是一選擇,2、引物設(shè)計,Oligo 6 （引物評價）* Primer Premier （自動搜索）* Vector NTI Suit （綜合分析） Primer Express(實時定量PCR引物和探針設(shè)計) Omiga Dnastar Primer3 （在線服務(wù)）*,3、同源序列比較,NCBI的BLAST; ExPASy的Alignment GeneDoc 3.2 Clustal X Vector NTI Omiga，Bioxm ，LaserGene，pcgene等,4、質(zhì)粒作圖,Gene Construction Kit WinPlas 2.7 Plasmid Premier2.02 Pl

4、asmid Toolkit,5、結(jié)構(gòu)域(motif)查找,推薦軟件：Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0的結(jié)構(gòu)域查找功能與它的引物設(shè)計一樣強，結(jié)果能以圖形、表格、序列三種方式輸出。同時還提供了一些未知的結(jié)構(gòu)域的列表；當然軟件本身也提供了大量的已知結(jié)構(gòu)域的序列。,6、RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,RNAdraw RNAStructure,7、 蛋白分析 軟件,二級結(jié)構(gòu)分析 ：Antheprot 4.5 三維結(jié)構(gòu)顯示 ：RasMol Cn3D,8、 格式轉(zhuǎn)換,各種軟件為了自己軟件的需要有不同的格式，對我們使用數(shù)據(jù)帶來了困難；格式轉(zhuǎn)換軟件能幫助用戶解決這一問題。 推薦軟件

5、：Seqverter 1.3 使用簡單，填寫輸入文件和輸出文件名就可以完成格式轉(zhuǎn)換。而且能夠轉(zhuǎn)換的格式非常之多是其它軟件所無法比擬的。另外，它可在線升級以讀寫更多格式文件。,9、 電泳圖譜分析,推薦軟件：band leader 3.0 提供處理DNA或蛋白分子凝膠電泳圖象和從凝膠電泳圖象獲得相關(guān)數(shù)據(jù)的工具。它可以對電泳圖譜進行半定量分析，識別掃描得到的WINDOWS圖象格式 .BMP，是一個難得的好軟件。,10、序列綜合分析軟件,pcgene BioEdit LaserGene DNASIS DNATools DNAclub Jellyfish Omiga Vector NTI Suite （

6、Bioxm）,三、應(yīng)用實例 -PCR引物設(shè)計及相關(guān)軟件使用,Sense primer,Antisense primer,選擇模板序列保守區(qū)域,1、引物設(shè)計原則,引物長度 堿基分布的均衡性 Tm值 引物二級結(jié)構(gòu) 引物3端 引物5端 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 自由能分布,概述,引物長度,一般引物的長度為15-30 bp，常用的長度為18-21bp。過長或過短都不合適，為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)，長度大于24 核苷的引物并不意味著更高的特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。引物過短會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp是必要的（18bp的序列在人類基因組中

7、只會出現(xiàn)一次）。,決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度 Tm =（g + C）* 4 +（a + T）* 2,同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個 GC含量一般40-60%，以45-55為宜 GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性 GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。,堿基分布的均衡性,有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi)，這時應(yīng)盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。,引物Tm值,一般要求：55-65。 應(yīng)盡可能保證上下游引物Tm值一致，一般差異

8、控制在2 以內(nèi)。 （引物的退火溫度相差小于5一般不會影響PCR的產(chǎn)率，理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在5580間變化，有說接近72為最佳） 上下游引物Tm值與產(chǎn)物Tm值一般應(yīng)控制在20 以內(nèi)。 一般采用較低引物Tm值-5作為PCR退火溫度。,一對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5端加適量的A、T或G、C尾巴。若G+C含量太低，可在5端加上一些G或C，若GC含量太高，可在5端加上一些A或T。,引物二級結(jié)構(gòu),引物二聚體（引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性 ） 盡可能避免兩個引物分子之間3端有有較多堿基互補 發(fā)夾結(jié)構(gòu)（引物自身連續(xù)互

9、補堿基不能大于3bp ） 尤其是要避免引物3端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。 （兩項結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5為好，引物中間或5端可適當放寬）,兩引物之間不應(yīng)該存在互補性，尤應(yīng)避免3端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。,引物3端,引物的延伸從3端開始，因此3端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴增完全失敗。 引物3端的堿基一般不用A（3端堿基序列最好是G、C、CG、GC）。另外引物間3端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。,3端的連續(xù)3個G 或C ，

10、如GGG或CCC，會導(dǎo)致引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā),引物5端,引物5端可以有與模板DNA不配對堿基（對PCR 影響不大），常在5端引入修飾位點或標記物。 5端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點序列（酶切位點5端加上適當數(shù)量的保護堿基）。 5端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的點突變以作研究。 5端標記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。,雙酶切位點，有利于定向克隆，2-3個保護堿基，一般加CG。計算引物Tm 值時并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進行互補性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。,引物的內(nèi)部穩(wěn)定性,過去認為，引物3端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進行延伸，故3端最好為G或C。 現(xiàn)

11、在的觀點認為，引物的5端應(yīng)是相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3端盡可能選用A或T（有說不適宜用A），少用G或C。,若模板不很清楚，引物3端最后一個堿基最好為T，其次是G或C，而不選A，國外資料表明，當末位為T時，即使在錯配的情況下也能引發(fā)鏈的合成，而末位為A時，錯配時引發(fā)大大降低，G或C居中，可見，模板很清楚時選A可以提高特異性。,自由能分布,G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性（結(jié)合的強弱程度）。 一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對較低，且不要超過9 （絕對值，一般考慮末端5個

12、堿基的G。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3末端穩(wěn)定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發(fā)。因此在復(fù)雜模板的擴增體系中，3末端5聚體的G應(yīng)大于-9.0kcal/mol） ，如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯誤引發(fā)。引物的3端的G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）,3末端雙鏈的G是02 kcal/mol時，PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在6時只有40%、到8時少于20%、而10時接近于0。,引發(fā)效率（引物唯一性）,選用的引物序列就應(yīng)當是唯一的，即在模板中沒有重復(fù)序列 好的設(shè)計工具會提供一個引物異位引發(fā)的評價指

13、標，如Oligo 6.0 的false priming efficiency，即異位引發(fā)效率，這個值是由程序根據(jù)引物自身二級結(jié)構(gòu)的能量、錯配的類型、錯配離3末端的距離等因素綜合計算而得出，當此值大于200時便很有可能引發(fā)擴增。如所用工具無量化指標，則可依據(jù)經(jīng)驗，當引物與模板在非預(yù)期位置退火，超過70%的堿基能互補配對，或引物3末端連續(xù)8個或以上堿基配對，則認為有引發(fā)的可能。,2、具體引物設(shè)計過程,一般引物設(shè)計 測序引物設(shè)計 5端引入限制性內(nèi)切酶位點或標記引物設(shè)計 簡并引物設(shè)計 特殊需求引物設(shè)計,參數(shù)設(shè)置,默認引物長度 - 默認值為25 引物對搜索最大值 - 默認值為100 核酸濃度 -默認值為

14、250 pM 單價離子濃度 - 默認值為50 mM 游離Mg2+離子濃度 - 默認值為1.5 mM,評分參數(shù) Rating parameters 評分參數(shù)窗口是用來設(shè)定二級結(jié)構(gòu)在引物評分中的權(quán)重系數(shù)二級結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定引物評分就會越低相對于在引物中間形成的二級結(jié)構(gòu)來說3 末端的二級結(jié)構(gòu)對PCR擴增的影響會更大為了將這一效應(yīng)計算在內(nèi)軟件將3 末端的二級結(jié)構(gòu)的自由能數(shù)值G減去1 這一修正會使3 末端的二級結(jié)構(gòu)顯得更加穩(wěn)定,(1) Primer premier 5.0使用介紹,參數(shù)設(shè)置,序列獲取及同源性比較,比對軟件和方式多，這里演示下Omiga，和primer,載入序列,Preimer Premier

15、啟動界面,Load sequence,粘貼序列窗口 這一窗口使得一段核酸序列通過選擇以四種不同的方式粘貼上去（CTRL-V）,基本信息,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8種密碼子偏好,Choose a function,引物設(shè)計界面,First you can design the primer manually,Sense strand or anti-sense strand

16、,Useful information of the primer,引物搜索選項設(shè)定,引物類型,搜索模式,5引物位置范圍,3引物位置范圍,產(chǎn)物大小范圍,引物長度,引物手動搜索選項設(shè)定,搜索結(jié)果,28對引物,引物分值 100分為滿分,每對引物的信息,雙擊選中一對引物,引物信息,回到主窗口,引物及產(chǎn)物信息,是否出現(xiàn)hairpin,dimer,false priming and cross dimer,引物編輯,引物編輯,Edit primer here,Analysis the edit result,Accept the edit result Return to the main window,(2) Oligo 6.44使用介紹,啟動界面,Open sequence file,3個彈出窗口,Melting temperature,G Interna