1、幾種酶制劑檢測方法介紹,飼料酶制劑,現(xiàn)市場上常見的飼料酶制劑多為復(fù)合酶，其成分木聚糖酶、-淀粉酶、（酸性或中性）蛋白酶、甘露聚糖酶、纖維素酶、-葡聚糖酶中的幾種。 如何準(zhǔn)確檢測其中的一種酶制劑的活性？,酶制劑檢測原理,酶與一般催化劑最主要的區(qū)別之一是它具有高度的專一性。,酶制劑檢測原理,樣品檢測： 酶制劑檢測應(yīng)用酶對底物專一性的特點(diǎn)，采用高純度底物，專一檢測某種酶制劑對底物的降解，然后測定產(chǎn)物含量（分光光度計(jì)）。 標(biāo)準(zhǔn)曲線： 通過用其高純度的產(chǎn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過分光光度計(jì)的讀數(shù)查出對應(yīng)的產(chǎn)物含量，然后計(jì)算酶活。,酶制劑檢測原理,A. -淀粉酶,1.碘淀粉顯色法 利用淀粉遇碘變藍(lán)的反應(yīng)，檢測出

2、未被淀粉酶分解的淀粉，運(yùn)用分光光度計(jì)測定碘反應(yīng)藍(lán)值的變化，然后查表讀取酶活。 特點(diǎn)：測定-淀粉酶的碘淀粉顯色法是專一性較高、操作較簡便、準(zhǔn)確性也較高的方法。,A. -淀粉酶,2. DNS顯色法 原理：淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，將3，5二硝基水楊酸試劑還原生成3氨基5硝基水楊酸的顯色基團(tuán)，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與糖的濃度成正比，故可求出麥芽糖的含量。 特點(diǎn)：專一性不高，易受其他淀粉酶（主要是-淀粉酶）的干擾，因此，碘淀粉顯色法應(yīng)用較多。,B. 蛋白酶,1. Folin法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，產(chǎn)生酪氨酸等酚基氨基酸，在堿性條件下，酚基氨基酸與Folin試劑反應(yīng)生產(chǎn)藍(lán)色物質(zhì)，于680nm比色

3、測定光吸收值，計(jì)算酶活力。 該法的準(zhǔn)確性及靈敏度都較高，在國內(nèi)已得到公認(rèn)，是應(yīng)用最廣的方法，我國的部頒標(biāo)準(zhǔn)及各大酶制劑生產(chǎn)企業(yè)都采用該法。,B. 蛋白酶,2. 紫外分光光度法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，產(chǎn)生酪氨酸等酚基氨基酸，利用酪氨酸在280nm處有特征性吸收峰,測定計(jì)算酶活。 特點(diǎn)：紫外線操作比Folin法簡便，但靈敏度僅為Folin法的1/10。,C. 產(chǎn)還原糖酶制劑,現(xiàn)今采用的還原糖法通常是比色法，黃色的3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顯色反應(yīng)與不同聚合度同源寡糖還原性末端的含量成正比。 特點(diǎn)：易于操作，價格低廉

4、，方便快速，重復(fù)性好,C. 產(chǎn)還原糖酶制劑,能產(chǎn)生還原糖的酶有：包括纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶等。 半纖維素酶是分解半纖維素(包括各種降戊糖與聚己糖)的一類酶的總稱,主要包括-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。,C. 產(chǎn)還原糖酶制劑,1. 還原糖法 2. 粘度法 3. 瓊脂平板擴(kuò)散法 4. 可溶性的染色底物,1. 還原糖法,還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。,2. 粘度法,原理：酶作用于具粘性的非淀粉多糖底物，使粘度下降，通過粘度計(jì)測定流速改變來計(jì)算酶活力。該法靈敏度較高，可形象反映外切酶在

5、動物體內(nèi)的作用方式，較適宜于飼用酶活性的測定。 特點(diǎn)：重復(fù)性差 ，費(fèi)時、操作復(fù)雜、單位難以換算成國際單位 。,3. 瓊脂平板擴(kuò)散法,原理：將NSPS 底物與瓊脂混融制成瓊脂平板，將酶樣點(diǎn)于瓊脂板上的小孔中，培養(yǎng)一定時間，選用能與底物發(fā)生顯色反應(yīng)的顯色劑染色，顯示出染色背景區(qū)和無色透明的水解區(qū)，水解區(qū)直徑與酶量的對數(shù)呈正相關(guān)，由水解區(qū)直徑計(jì)算酶活力。 特點(diǎn)：靈敏度高，是還原糖法的100倍，測定所需樣品量微，無需特殊設(shè)備。,4. 可溶性的染色底物,原理：人工合成的含色原基團(tuán)的底物在酶的作用下釋放出有色物質(zhì)，利用分光光度計(jì)比色測定有色物質(zhì)含量，計(jì)算酶活力。 特點(diǎn)：重復(fù)性好，操作簡便，靈敏度較高 ，但

6、合成底物與天然底物有區(qū)別，對結(jié)果的準(zhǔn)確性可能有影響 ，并且底物昂貴。,D. 脂肪酶,原理：脂肪酶在一定條件下 ，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯和甘油，所釋放的脂肪酸，可用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行中和滴定，用pH或酚酞指示反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)消耗的堿量，計(jì)算其酶活。 反應(yīng)式為： RCOOH + NaOH RCOONa + H2O,E. 植酸酶,1.國標(biāo)法（釩鉬酸銨法） 原理：利用植酸酶水解植酸鈉產(chǎn)生無機(jī)磷，再加入酸性鉬釩試劑終止反應(yīng)，同時與無機(jī)磷反應(yīng)生成黃色釩鉬磷絡(luò)和物，在415nm比色測定含磷量，再以標(biāo)準(zhǔn)植酸酶為參照物，間接計(jì)算被測樣品中植酸酶的含量。,E. 植酸酶,2.硫酸亞鐵鉬藍(lán)法 原理：利用植酸酶可

7、以水解植酸酶釋放無機(jī)磷的原理，通過加入鹽酸使水解反應(yīng)停止，然后加入鉬酸銨及FeSO47H2O的混合液使溶液顯色，在720nm波長下測定其吸收值，以標(biāo)準(zhǔn)酶為參照物，間接計(jì)算被測樣品中植酸酶的含量。,E. 植酸酶,3.丙酮磷鉬酸銨法 原理：磷酸鹽與過量的鉬酸銨在酸性條件下混合后，可慢慢生成黃色磷鉬酸銨，加入丙酮后使黃色物質(zhì)提出來，在355nm波長處測吸光度，靈敏度增加10倍。 特點(diǎn)：釩鉬酸銨法靈敏度最高，丙酮法穩(wěn)定性最好，抗干擾能力較強(qiáng)。,E. 植酸酶,4. VC鉬藍(lán)法 原理：該方法是利用植酸酶可以水解植酸磷釋放無機(jī)磷的原理，通過加入三氯乙酸使反應(yīng)停止，然后加人鉬酸銨與VC的混合液，使溶液顯色，在

8、820nm波長下測定吸光度，再以標(biāo)準(zhǔn)磷溶液的吸光度及磷溶液濃度對應(yīng)的酶活單位建立直線回歸方程，最后以待測樣品吸光度代人方程，計(jì)算出酶活性。,影響酶活力的主要因素,A.底物種類和濃度 B.酶活力單位定義 C.酶反應(yīng)pH值 D.酶反應(yīng)溫度 E.酶反應(yīng)時間,A.底物種類和濃度,同種方法采用不同底物測定，結(jié)果相差很大。 例如木聚糖酶的檢測，燕麥木聚糖與樺木木聚糖的測定結(jié)果就有明顯差距。,底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響圖,B. 酶活力單位定義,國際酶學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1umol底物的酶量，稱一個國際單位（IU）。 酶活計(jì)算公式： 酶活性 (U/g) = A D 1000 0.2101

9、50.13 W 其中: A 比色測定的木糖量，mg/ml； D 稀釋倍數(shù)； 1000 當(dāng)量換算因數(shù)，mmol- umol ； W 酶樣品重量，g； 150.13 木糖的分子量，mg/mmol； 10 反應(yīng)時間，分鐘。,B. 酶活力單位定義,木聚糖酶的活性定義A：在測定條件下，1秒鐘從燕麥木聚糖中產(chǎn)生1nmol木糖所需的酶量。 酶活計(jì)算公式： 酶活（IU）= A D 1,000,000 0.2 600 150.13 W 其中: A 比色測定的木糖量，mg/ml； D 稀釋倍數(shù)； 1,000,000 當(dāng)量換算因數(shù)，mmol- nmol； W 酶樣品重量，g； 150.13 - 木糖的分子量，mg/

10、mmol。 600 反應(yīng)時間，秒。,C. 酶反應(yīng)pH值,pH影響酶活力的因素: 影響酶蛋白構(gòu)象，過酸或過堿會使酶變性。影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。影響酶和底物分子中另一些基團(tuán)解離，這些基團(tuán)的離子化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構(gòu)象。影響酶與底物的結(jié)合，極度pH的條件引起酶蛋白的變性。,C. 酶反應(yīng)pH值,最適pH：使酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大時的介質(zhì)pH。 最適pH一般接近在48 之間.,D. 酶反應(yīng)溫度,溫度對酶促反應(yīng)速度的影響有兩個方面： 提高溫度，加快反應(yīng)速度。 提高溫度，酶變性失活。 這兩種因素共同作用，在小于最適溫度時，前一種因素為主；在大于最適溫度時，后一種因素為主。 最適溫度就是這兩種因素綜合作用的結(jié)果。,D. 酶反應(yīng)溫度,E. 酶反應(yīng)時間,酶反應(yīng)方程式： 隨著生成物濃度的增加，酶反應(yīng)速度減慢，當(dāng)生成物達(dá)到某一濃度，酶反應(yīng)即停止。,E. 酶反應(yīng)時間,從圖中可以看到，反應(yīng)速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時間的延長，由于底物濃度降低，產(chǎn)物反饋抑制，逆反應(yīng)速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反應(yīng)速度逐漸下降，最后完全停止。,E. 酶反應(yīng)時間,在測定酶促反應(yīng)速度時，要避免以上干擾因素，必須在酶促反應(yīng)初期進(jìn)行，在最初這段時間內(nèi)的反應(yīng)速度稱之為反應(yīng)初速度，在過量的底物存在下，反應(yīng)初速度與酶濃度成正比。,F.激活劑