1、Hoechst染色:hoechst可以穿過(guò)活細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合 (主要為凋亡活細(xì)胞)在紫外光下將核染為藍(lán)色. Hoechst染細(xì)胞核會(huì)影響共聚焦顯微鏡對(duì)該樣本其他熒光的觀察效果.hoechst有hoechest33342和hoechst33258兩種 hoechsts33258，hoechst33342二者區(qū)別不大，但是hoechst33342對(duì)細(xì)胞的毒性作用更小一些，所以一般來(lái)說(shuō)hoechsts33258用于細(xì)胞固定后再染色，而hoechst33342則可以對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行染色！染色步驟PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色: 是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，常用于細(xì)胞

2、凋亡檢測(cè). 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料(紅色），它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI 能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅.用PI單一染色觀測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，只能表示細(xì)胞的壞死情況，而不是凋亡（當(dāng)然晚期凋亡PI亦可著色）。但是如果您只是想知道細(xì)胞的死亡情況，而不是仔細(xì)區(qū)分壞死或凋亡，那么PI單一染色也可以。但是如果您一定要認(rèn)定細(xì)胞的凋亡，那么PI單一染色顯然不夠！annexin-v染色細(xì)胞凋亡早期,細(xì)胞膜標(biāo)志發(fā)生改變.其中,磷脂酰絲氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的條件下與其高親和力特

3、異性結(jié)合.這樣,Annexin-v 染色陽(yáng)性,表示細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài).Annexin-V結(jié)合不同的熒光抗體,就可以利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Annexin V用FITC標(biāo)記發(fā)綠色熒光；如果用PE標(biāo)記就發(fā)紅色熒光。JC-1染色 JC-1是一種陽(yáng)離子染料，可以在線粒體內(nèi)聚集，低濃度時(shí)主要以單體(monomer)存在，發(fā)射光以綠光(525nm)為主；而在高濃度時(shí)則可以形成多聚體(aggregation)，發(fā)射光以紅光(-590nm)為主。線粒體本身存在一定的極性(polarization)，其外膜為負(fù)極，內(nèi)膜為正極。電位差由Ca2+、Na+和H+流調(diào)控。

4、當(dāng)線粒體狀態(tài)良好時(shí)對(duì)JC-l攝取量少，因而在線粒體內(nèi)主要以單體的形式存在綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度的比值較高。在線粒體發(fā)生去極化(depolarization)時(shí)，線粒內(nèi)JC-l的濃度較高，多以多聚體的形式存在，綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度的比值降低。JC-1染色的綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度僅取決于線粒體的膜電勢(shì)(membrane potential)，而與線粒體的形態(tài)、體積和密度都無(wú)關(guān)，因而能更好地反映線粒體的功能狀態(tài)。由于凋亡發(fā)生的早期存在線粒體的去極性，因此，JC-1染色被用于檢測(cè)凋亡的早期發(fā)生。其實(shí)驗(yàn)方法如下。JC-l染色非常簡(jiǎn)單。首先可將成品JC-1以DMSO配成儲(chǔ)存液(15mg/ml)，儲(chǔ)存于-20，用時(shí)以

5、培養(yǎng)液稀釋至10ug/ml終濃度。對(duì)貼壁細(xì)胞可以直接棄去培養(yǎng)液，漂洗細(xì)胞后直接加入染色液，10-30min后在熒光顯微鏡下或者激光共聚焦下觀察。線粒體狀態(tài)好時(shí)細(xì)胞以綠色為主，當(dāng)紅光信號(hào)增強(qiáng)時(shí)，紅綠相疊，以橙色為主。該染色運(yùn)用于懸浮細(xì)胞時(shí)還可以通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，收集紅/綠信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算其強(qiáng)度比。 鈣黃綠素-AM(Calcein-AM):Calcein -AM本身并不是熒光分子，但通過(guò)活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用，Calcein -AM能脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光（激發(fā)：490 nm，發(fā)射：515 nm）。因此Calcein -AM僅對(duì)活細(xì)胞染色細(xì)胞活力鑒定臺(tái)盼藍(lán)染色法原理：細(xì)胞

6、損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA 結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。用品：1. 4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱(chēng)取4g臺(tái)盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml，用濾紙過(guò)濾，4度保存。使用時(shí)。用PBS稀釋至0.4%。2. 吸管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、顯微鏡步驟：1、制備單細(xì)胞懸液。并作適當(dāng)稀釋?zhuān)?06 細(xì)胞/ml）2、染色：細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9:1混合混勻。3、計(jì)數(shù)：在三分鐘內(nèi)，用計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞結(jié)果統(tǒng)計(jì)：鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。根據(jù)下式求細(xì)胞活力：活細(xì)胞率（%）= 活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）10

7、0注意事項(xiàng)：臺(tái)盼藍(lán)染細(xì)胞時(shí)，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。否則，部分活細(xì)胞也會(huì)著色，會(huì)干擾計(jì)數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)染色原理通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性，細(xì)胞即可被認(rèn)為已經(jīng)死亡。臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)是檢測(cè)細(xì)胞膜完整性最常用的生物染色試劑。健康的正常細(xì)胞能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，而死亡的細(xì)胞，膜的完整性喪失，通透性增加，細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。依據(jù)此原理，細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，可通過(guò)顯微鏡，直接鏡下計(jì)數(shù)或拍照后計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞存活率比較精確的定量分析。試述臺(tái)盼藍(lán)染發(fā)鑒別死活細(xì)胞的原理，試分析染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)本來(lái)是活細(xì)胞也被染色的原因 死細(xì)胞的細(xì)胞膜無(wú)屏障作用，臺(tái)盼藍(lán)馬上進(jìn)入細(xì)胞而顯藍(lán)色?；罴?xì)胞細(xì)胞膜有選擇透性，對(duì)臺(tái)盼藍(lán)的透性小，進(jìn)入細(xì)胞慢。若染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，臺(tái)盼藍(lán)可能通過(guò)胞吞或胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。方法 特點(diǎn) 染細(xì)胞類(lèi)型染色部位激發(fā)光顏色意義Hoechst染色活細(xì)胞(主要是早期凋亡細(xì)胞)細(xì)胞核紫外激發(fā)核染藍(lán)色檢測(cè)早期凋亡PI染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期細(xì)胞細(xì)胞核綠光激發(fā)！核染紅色檢測(cè)死細(xì)胞或凋亡晚期細(xì)胞an