1、第七章 免疫組化結果的分析和判斷 （要求：理解， 熟記， 會用）,第一節(jié) 免疫組化結果的判斷原則 免疫組化結果的判斷原則概括起來有以下幾點：,必須同時設對照染色。沒有對照染色的免疫組化染色結果是不可信的。 抗原表達必須在特定部位。如LCA應定位在細胞膜上；CK應定位在細胞漿內； PCNA及p53蛋白應定位在細胞核內；EMA應定位在細胞膜上，等等。不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。,陰性結果不能視為抗原不表達。由于檢測方法靈敏度有高低之分，有時可因染色方法靈敏度不夠，而導致陰性反應，判斷時應注意。,盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細胞的陽性表達，特別是酶免疫標記。因為這類陽性著

2、色多系內源干擾，或系人為因素所致。,對免疫組化標記結果的意義不能絕對化，應結合臨床資料、X線等影像學及實驗結果綜合分析。,第二節(jié) 對照染色設計,(一）對照染色的目的 設對照的目的是為了排除假陰性和假陽性。假陰性的原因主要有三：組織處理不當，抗原丟失過多或被遮蔽；抗體失活、效價過低或稀釋度不合適（主要指一抗，即特異性抗體）；染色步驟遺漏及差錯，或顯色劑的選擇、緩沖液的pH和離子強度不當等。,假陽性均系由多種因素造成的非特異著色所致，原因主要有：自發(fā)熒光或內源酶等干擾；抗體試劑不純(特別是一抗）；操作失誤，如污染、切片干枯或顯色劑操作不當等；Fc受體的干擾，等等。,（二）對照的種類及其選用目的 對

3、照染色大致可分為陽性組織對照、陰性組織及陰性試劑對照和自身對照四大類：,陽性組織對照 指用已證實含有靶抗原的同源及不同源組織切片或細胞涂片與待檢實驗切片同時作同樣處理和免疫染色的組織對照。正確的結果應呈現陽性，目的是為了證實所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。,陰性組織對照 指用已證實不含靶抗原的同步處理和免疫標記染色的組織對照。正確的結果應為陰性，目的是除外假陽性。,陰性試劑對照 是指用于證實在免疫組化染色中所用試劑，尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性而所設立的同步免疫染色對照，包括有：空白對照；替代對照；吸收試驗和抑制試驗，等。目的在于除外假陽性和證實所用免疫組化試劑及其技術

4、方法的有效性和待檢實驗切片免疫標記陽性結果的可靠性。,空白對照 指以緩沖液（PBS、TBS等）取代第一抗體（主要的，必要時還可做第二抗體及橋聯抗體的空白取代），其他各步不變的試劑對照染色，結果應為陰性。,取代對照 指以所用方法第一抗體同源動物的正常血清，或與本實驗無關的抗體(靶生物缺如的)取代第一抗體，其他步驟不變的試劑對照染色，結果應為陰性。 吸收試驗 是指用事先經過量抗原吸收的第一抗體上清液取代第一抗體，其他步驟不變的免疫染色試劑對照。結果應是陰性或陽性著色明顯減弱（吸收不全時）。,抑制試驗 是指用標記抗體和未標記抗體（可以是一抗，也可以是二抗或橋抗體）兩者的混合物作試劑，其他步驟不變的免

5、疫組化染色試劑對照，結果其陽性著色應成比例的減弱（等量或1：9）。此試劑對照多用于直接法。,這類陰性試劑對照的選用原則是：空白對照不能省，其他對照在預實驗中應盡量多做，尤其是應用新抗體試劑；對照必需與實驗片同步進行染色；對照的結果應附合要求。,自身對照 是指在同一標記切片上的自身組織成分的陰性背景對照。即與靶抗原陽性反應細胞或成分相鄰的陰性背景結構的顯色，結果應為陰性或著色較淺，需與陽性著色成分呈鮮明對比。目的在于排除內源性干擾產生的假陽性和因抗原彌散移位造成的錯誤結果。,第三節(jié) 非特異染色,非特異染色是指免疫組化染色過程中產生的非靶抗原的呈色結果，屬假陽性，又稱背景著色，能嚴重干擾免疫組化染

6、色結果的正確判斷，應竭力避免或減輕。其原因涉及免疫組化染色流程的各個環(huán)節(jié)，可來自：,內源性干擾(自發(fā)熒光、內源酶、內源性生物素等)；試劑污染(質量差，交叉反應，Fc受體干擾等)；組織處理不當(組織固定不及時或固定不良所導致的抗原彌散移位、洗滌不充分所導致的游離試劑殘留等)。,糾正的方法視原因而異，可在預實驗基礎上，采用有針對性的糾正對策，即對癥下藥(具體糾正方法不展開講了，同學們可以自己閱讀講義p123-126) 。,第四節(jié) 陽性標記的形態(tài)特征和判斷,免疫組化標記具有一定形態(tài)特點，若能熟練掌握則有助于對免疫組化標記結果的正確判斷。特點包括定性、定位和定量三方面。,免疫顯色強度和陽性細胞密度是定

7、性定量指標，實際工作中常采用強度和密度結合的方法綜合計量，與抗原含量有關；陽性細胞的著色形態(tài)及組織分布特點主要是定位指標，與功能有關。,一、陽性標記免疫特征：分弱(+)、中(+)、強(+)三級。免疫熒光法（FITC為例） 則表現為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光；,免疫酶標記（HRP- DAB/H2O2）則表現為淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，后者耀眼易見。一般圖片照像，原則上多取強陽性區(qū)域。,二、陽性標記細胞學特征（以HRP-DAB/H2O2為例） 可分為胞膜型；胞核型；胞質(漿)型；微絨毛型和復合型（胞膜-胞質兼有，胞核-胞質兼有，或微絨毛-胞質兼有）等五種陽性細胞類型。這

8、與抗原所在部位相關聯，但應注意排除因組織固定不好引起的抗原彌散假象，尤其是復合型圖像。,三、陽性標記組織學特征（以HRP-DAB/H2O2為例） 免疫組化染色陽性細胞在組織中的分布排列形式可以有如下7種：局灶型；彌漫型；片塊型；網狀型；腺管型；腔緣型和菊團型，等。這主要取決于抗原抗體復合物在細胞內的分布和陽性細胞在組織內的群體分布特點。,四、陽性標記強度特征 依照細胞陽性著色程度（抗原含量），可分為弱陽性（+）1分；中等陽性（+）2分；強陽性（+）3分。依照陽性細胞數量，可分為：弱陽性（+ ，指陽性細胞總數在25%以下）；,中等陽性（+,指陽性細胞總數在25%49%)；強陽性（+ ，指陽性細胞

9、總數在50%以上)。目前多采用積分綜合計量。計算公式為：（+）%x1 +（+）%x2+（+）%x3；總數值1.5者為(+)。至少隨機觀察5-10個HPF。,第五節(jié) 染色失敗的可能原因,免疫組化染色的基本要求有二：實驗切片的陽性抗原定位準確，呈色鮮明，背景著色淺或無，二者的比值應大于1（陽性/背景）；對照染色的結果應附合要求。否則，所得實驗結果都是錯誤的，或為假陽性或為假陰性。,假陽性是指實驗切片呈陽性，陰性組織對照或陰性試劑對照也呈陽性的結果，謂之假陽性。其原因與內源性干擾，試劑不純，交叉反應等有關。,假陰性是指實驗切片呈陰性，陽性組織對照及陰性試劑對照也均呈陰性的結果，謂之假陰性。其原因與組織處理不當，組織細胞抗原丟失或試劑錯誤(如漏加、錯加、失效、變質等),操作失誤等有關。,對照結果判斷：,染色失敗原因： 均為陰性 均為弱陽性（除陰性對照） 背景染色過深 陽性對照好，待檢標本弱陽性 陽性對照無背景，待檢標本背景深,判斷原則： 實驗設計 抗體選擇 抗原定位性 抗原分布不均一性,識別假陰