1、第2章 遺傳圖的繪制,結(jié)構(gòu)基因組的研究策略,為何要繪制遺傳圖與物理圖,1)基因組太大,必需分散測(cè)序,然后將分散的順 序按原來(lái)位置組裝,需要圖譜進(jìn)行指導(dǎo)。 2)基因組存在大量重復(fù)順序,會(huì)干擾排序,因此 要高密度基因組圖。 3)遺傳圖和物理圖各有優(yōu)缺點(diǎn),必須相互整合校正,DNA測(cè)序有一個(gè)極大的局限性：即使是最精確的技術(shù)，在一個(gè)反應(yīng)中也很難測(cè)出大于750bp的序列。這就需要將大分子分解為片段。,問(wèn)題：分析基因組的重復(fù)區(qū)域時(shí)會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤。,因此，必須首先建立一個(gè)基因組的圖譜，通過(guò) 標(biāo)明基因和其他顯著特征的位置，為測(cè)序提供指導(dǎo)。 一旦得到了基因組的圖譜，測(cè)序階段可以采用以下 方法進(jìn)行： 全基因組鳥(niǎo)槍法（w

2、hole-genome shotgun method） 全基因組鳥(niǎo)槍法是一種快速獲得真核基因組的方法。 2. 克隆重疊群法（clone contig method）：（作圖法測(cè)序，限制測(cè)序）。 這種逐步測(cè)序的方法花時(shí)間多，但精確。,克隆重疊群法：contig，指相互間存在重疊順序的一組克隆。根據(jù)重疊順序的相對(duì)位置將各個(gè)克隆首尾連接，覆蓋的物理長(zhǎng)度可達(dá)百萬(wàn)級(jí)堿基對(duì)。在單個(gè)的重疊群中，采用鳥(niǎo)槍法測(cè)序，然后在重疊群內(nèi)進(jìn)行組裝。由上至下。 直接鳥(niǎo)槍法：首先進(jìn)行全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序，再以基因組圖的分子標(biāo)記為起點(diǎn)，將鳥(niǎo)槍法DNA片段進(jìn)行組裝。根據(jù)高密度的基因組圖分子標(biāo)記，檢測(cè)組裝片段是否處在正確的位置，校正

3、因重復(fù)順序的干擾產(chǎn)生的序列誤排。由下至上,全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序和克隆重疊群法測(cè)序最后 都必須將DNA序列回歸到基因組圖上，因此 基因組圖的繪制是基因組測(cè)序和組裝的核心內(nèi)容 之一，是基因組全面測(cè)序的必要前提。 傳統(tǒng)上將基因組作圖方法分為兩類(lèi)。 1. 遺傳作圖 2. 物理作圖,2.1 遺傳圖譜與物理圖譜,1）遺傳作圖（Genetic mapping）：采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其它DNA序列標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。這一方法包括雜交實(shí)驗(yàn)，家系分析。遺傳圖距單位為厘摩(cM), 每單位厘摩定義為1%交換率。 2）物理作圖（Physical mapping）：采用分子生物學(xué)技術(shù)直接將DNA分子標(biāo)記、基因

4、或克隆標(biāo)定在基因組實(shí)際位置。物理圖的距離依作圖方法而異，如輻射雜種作圖的計(jì)算單位為厘鐳(cR), 限制性片段作圖與克隆作圖的圖距為DNA的分子長(zhǎng)度，即堿基對(duì)(bp, kb)。,2.1 基因組作圖的方法,通過(guò)遺傳圖譜，我們可以大致了解各個(gè)基因或DNA片斷之間的相對(duì)距離與方向，如哪個(gè)基因更靠近著絲粒，那個(gè)更靠近端粒等 遺傳距離是通過(guò)遺傳連鎖分析獲得的，使用的DNA厘摩標(biāo)志越多，越密集，所得到的遺傳連鎖圖的分辨率就越高 遺傳圖譜不僅是現(xiàn)階段定位基因的重要手段，即使在人類(lèi)基因組全物理圖譜建立起來(lái)之后，它依然是研究人類(lèi)基因組遺傳與變異的重要手段,2.2 遺傳作圖標(biāo)記,任何一類(lèi)圖譜都有可識(shí)別的標(biāo)記。遺傳圖

5、譜的標(biāo)記是什么呢？,2.2.1 基因標(biāo)記 在經(jīng)典遺傳學(xué)中，研究一種性狀的遺傳必須要求同一性狀至少2種不同的存在形式或稱(chēng)表型。 起初只有那些能通過(guò)視覺(jué)區(qū)分的基因表型用于研究。最初的遺傳圖譜是在20世紀(jì)初針對(duì)果蠅等生物使用基因作為標(biāo)記構(gòu)建的。,2.2.1 基因標(biāo)記,表型（phenotype) ：一個(gè)遺傳性狀必須以兩種替換形式或表型存在才能用于遺傳學(xué)分析 等位基因（allele）：每種表型是由不同的等位基因控制 肉眼分辨的表型：顏色、形狀等。如用于果蠅遺傳圖的構(gòu)建 生化表型：微生物遺傳學(xué)研究,2.2.1 基因標(biāo)記,人類(lèi)的生化性狀 ABO血型 HLA（人類(lèi)白細(xì)胞抗原） 復(fù)等位基因（multiple a

6、lleles）：人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）是最復(fù)雜最具多態(tài)性的體系，位于6 號(hào)染色體 HLA-DRBI（human leukocyte antigens-DRBI）基因位點(diǎn)至少有59個(gè)等位基因 HLA-B抗原編碼位點(diǎn)有60多個(gè)等位基因,ABO 血型基因座上具有編碼不同半乳糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)等位基因 其特異性決定了血型的差別,基因是非常有用的標(biāo)記，但并不是理想的。原因： 可用作標(biāo)記的基因十分有限，許多性狀都涉及 多基因。 2. 高等生物基因組中存在大量的基因間隔區(qū)，遺 傳圖中留下大片的無(wú)標(biāo)記區(qū)段。 3. 只有部分基因其等位基因成員可以通過(guò)常規(guī)實(shí) 驗(yàn)予以區(qū)分，因而產(chǎn)生的遺傳圖是不完整的。,2.2.1 基因標(biāo)

7、記,基因之外的作圖工具統(tǒng)稱(chēng)為DNA標(biāo)記。與基因標(biāo)記一樣，DNA標(biāo)記必須有至少兩個(gè)等位基因才是有用的。有三種類(lèi)型的DNA序列特征可以滿足這一要求： 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphisms, RFLP） 2. 簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（simple sequence length polymorphisms, SSLP） 3. 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP）,2.2.2 DNA標(biāo)記,遺傳標(biāo)記的發(fā)展： 第一代標(biāo)記 經(jīng)典的遺傳標(biāo)記（蛋白質(zhì)和免疫學(xué)的標(biāo)記） 70年代中后期，限制酶片段長(zhǎng)

8、度多態(tài)性（RFLP） 第二代標(biāo)記 85年，“小衛(wèi)星序列（minisatellite） 89年，“微衛(wèi)星序列（microsatellite） 第三代標(biāo)記 單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotide polymorphism ，SNP）,70年代發(fā)展起來(lái)的DNA重組技術(shù)、DNA克隆技術(shù)和DNA探針技術(shù) 為拓展遺傳圖譜的構(gòu)建途徑創(chuàng)造了技術(shù)條件 使人類(lèi)基因定位的方法從細(xì)胞及染色體水平過(guò)渡到分子水平 DNA水平的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標(biāo)，提高圖譜的 精確度、準(zhǔn)確性。遺傳圖譜的繪制進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代 現(xiàn)代遺傳圖譜的概念由Botstein D等(1980)首先提出，在此基礎(chǔ)

9、上，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）作為遺傳圖譜的第一代嶄新標(biāo)記得以問(wèn)世 。 限制性位點(diǎn)能夠用作基因標(biāo)記。廣泛應(yīng)用到基因組研究中?；蚧蚧蚪M可以用重疊的限制性片段來(lái)作圖。最終擴(kuò)展到整個(gè)序列，構(gòu)建連鎖圖譜,同一物種的亞種、品系或個(gè)體間基因組DNA 受到同一種限制性內(nèi)切酶作用而形成不同的酶切圖譜的現(xiàn)象，稱(chēng)為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP)。 這是由于基因組DNA某一位點(diǎn)上的變異有可能引起該位點(diǎn)特異性的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變，包括原有位點(diǎn)的消失或出現(xiàn)新的酶切位點(diǎn)，致使酶切片段長(zhǎng)度隨之發(fā)生變化而產(chǎn)生。,最早發(fā)現(xiàn)的DNA分子標(biāo)記RFLP：由于同源染色體同一區(qū)段DNA序列的差異，當(dāng)用限制酶處理時(shí)，可

10、產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的限制性片段,RFLP:restriction fragment length polymorphism, 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,RFLP是如何發(fā)現(xiàn)的?,在猶他州鹽湖城滑雪勝地艾爾塔的一場(chǎng)例行的學(xué)術(shù)討論中, 從事經(jīng)典人類(lèi)遺傳學(xué)研究的專(zhuān)家與從事分子生物學(xué)研究的專(zhuān)家進(jìn)行學(xué)術(shù)交流。分子生物學(xué)家從經(jīng)典遺傳學(xué)的研究中獲得靈感。,David Botstein,David Botstein開(kāi)創(chuàng)核酸限制性片段 長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)，用于標(biāo)志不同 個(gè)體間的基因差別，為后來(lái)的人類(lèi)基 因組計(jì)劃奠定了基礎(chǔ)。 PRINCETON, N.J. - Princeton University has named D

11、avid Botstein, a renowned geneticist, educator and pioneer of the Human Genome Project, as the new director of the Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics.,第1篇有關(guān)人類(lèi)RFLP實(shí)驗(yàn)論文,A Highly Polymorphic Locus in Human DNA Arlene R. Wyman and Ray White, MIT A locus in the human genome, not associated w

12、ith any specific gene, has been found to be a site of restriction fragment length polymorphism. The polymorphism was found by hybridizing a 16- kilobase-pair segment of single-copy human DNA, selected from the human genome library cloned in phage CH4A, to a Southern transfer of total human DNA diges

13、ted with EcoRI. DNAs from a number of individuals from within Mormon pedigrees as well as random individuals have been examined. The locus is highly variable, with at least eight alleles present, homozygotes accounting for less than 25% of the individuals examined. -PNAS | November 1, 1980 | vol. 77

14、 | no. 11 | 6754-6758,對(duì)RFLP的檢測(cè)主要是用Southern雜交的方法進(jìn)行 基本流程： 組織或細(xì)胞基因組DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移至濾膜加入探針雜交洗膜放射自顯影獲得反映個(gè)體特異性的RFLP圖譜。,RFLP多態(tài)性的產(chǎn)生與檢測(cè),所用的探針位于染色體的不同位點(diǎn)，可以作為一種分子標(biāo)記，構(gòu)建分子圖譜。,RFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)是： （1）遍布于整個(gè)基因組； （2）無(wú)表型效應(yīng),不受發(fā)育階段及器官特異性限制 （3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子； （4）結(jié)果穩(wěn)定、可靠； 用途：RFLP主要用于群體水平和系統(tǒng)發(fā)育研究上.進(jìn)行個(gè)體識(shí)別；繪制遺傳圖譜；目的基因定位；檢測(cè)群體

15、內(nèi)或群體間序列差異程度；輔助育種等。 自RFLP問(wèn)世以來(lái)，已經(jīng)在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、疾病的基因診斷等研究中得到了廣泛的應(yīng)用。,共顯性: （兩個(gè)親本的性狀在一個(gè)個(gè)體中同時(shí)出 現(xiàn)，沒(méi)有顯隱關(guān)系）,問(wèn)題： 克隆可表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難 DNA需要量大，實(shí)驗(yàn)操作較繁鎖，檢測(cè)周期長(zhǎng)成本費(fèi)用也很高。 RFLP分子標(biāo)記分布密度過(guò)于稀疏。 現(xiàn)已逐步被其他類(lèi)型分子標(biāo)記所取代。 RFLP是最早發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記，也被稱(chēng)為第一代分 子標(biāo)記。,2. 簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP),1) 可變排列的簡(jiǎn)單重復(fù)序列, 即重復(fù)次數(shù)不一, 在染色體的同一座位重復(fù)序列拷貝數(shù)不同; 2) SSLP的類(lèi)型:

16、 小衛(wèi)星序列(minisatellite), 有時(shí)又稱(chēng)可變串聯(lián) 重復(fù)（VNTR），重復(fù)單位較長(zhǎng)。重復(fù)序列為16-100個(gè)核苷酸，主要分布在染色體端粒及著絲粒 微衛(wèi)星序列(micrisatellite), 或稱(chēng)簡(jiǎn)單串聯(lián)重 復(fù)（STR），重復(fù)單位較短。重復(fù)序列只有2-6個(gè)核苷酸，分布在整個(gè)基因組。,microsatellite marker又稱(chēng)簡(jiǎn)單串連重復(fù)（short tandem repeat，STR），最重要的優(yōu)點(diǎn)是高度多態(tài)性，提供的信息量相對(duì)很大；另外可用PCR技術(shù)使操作實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，遺傳圖與物理圖研究中非常有用的工具 20世紀(jì)80年代后期,人們開(kāi)始應(yīng)用微衛(wèi)星序列(microsatellite

17、,MS)繪制圖譜。1994年底，美、法完成了以RFLP及微衛(wèi)星為標(biāo)志的遺傳圖譜.圖譜包含了5826位點(diǎn)，覆蓋4000cM，分辨率高達(dá)0.7cM1996年法國(guó)報(bào)道了完全以微衛(wèi)星DNA標(biāo)志構(gòu)建的遺傳連鎖圖，包含2335位點(diǎn)，分辯率為1.6cM,微衛(wèi)星序列（SSR）,共顯性,如何檢測(cè)SSR,根據(jù)簡(jiǎn)單重復(fù)順序兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)引物, PCR，經(jīng)聚丙烯胺凝膠電泳分辨.,SSR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是： （1）在基因組中隨機(jī)分布，檢測(cè)的多態(tài)性頻率高； （2）PCR特異引物，重復(fù)性好； （3）共顯性，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。 問(wèn)題是： （1）SSR需要測(cè)序和設(shè)計(jì)引物，因而需要大量 的人力、物力和時(shí)間； （2）另外其種屬特異性強(qiáng)，開(kāi)發(fā)

18、所需的費(fèi)用高 昂，因此一些實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了合作，共同開(kāi) 發(fā)微衛(wèi)星引物。,利用SSR標(biāo)記的關(guān)鍵是引物的設(shè)計(jì) 對(duì)于已經(jīng)進(jìn)行基因組全序列測(cè)定的生物或遺傳學(xué)研究比較經(jīng)典的生物，可以直接從其基因組進(jìn)行查找和利用有關(guān)程序進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)或利用別人已經(jīng)發(fā)表的引物來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)； 而對(duì)于沒(méi)有基因組序列信息的生物，就需要進(jìn)行有關(guān)引物的設(shè)計(jì)工作。,微衛(wèi)星序列標(biāo)記研究,1) 1982年Hamada等首次報(bào)道m(xù)icrosatrllite現(xiàn)象 (PNAS, 79:6564, 1982) 2) 1989年Weber等從GenBank中發(fā)現(xiàn)人類(lèi)基因組的8個(gè)位點(diǎn)中, 有7個(gè)位點(diǎn)存在(CA)n拷貝數(shù)的變化(Am.J.Hum.Genet.

19、, 44:388, 1989). 3) 現(xiàn)已證實(shí)人和老鼠基因組中平均每18-28 kb含有一個(gè)多態(tài)性(CA)n. 4) 獲取方法: a) 計(jì)算機(jī)搜尋; b) 用限制酶酶切基因組DNA, 構(gòu)建DNA文庫(kù)。合成簡(jiǎn)單寡聚重復(fù)核苷酸作為探針從庫(kù)中篩選.,SSLP標(biāo)記在基因組中的分布具有多態(tài)性頻率高以及分布比較均勻的特點(diǎn)，此外SSLP標(biāo)記可以采用PCR方法直接擴(kuò)增，經(jīng)聚丙烯胺凝膠電泳分辯，現(xiàn)已成為主流的分子標(biāo)記，又稱(chēng)為第二代分子標(biāo)記。,SSR標(biāo)記應(yīng)用：現(xiàn)已證明微衛(wèi)星DNA 存在于絕大多數(shù)真核生物基因組中，因此已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、品種純度檢測(cè)及遺傳多樣性分析、重要性狀基因的定位等。,3. SNP(單

20、核苷酸多態(tài)性),SNP是指同一物種不同個(gè)體基因組DNA的等位序列上單個(gè)核苷酸存在差異的現(xiàn)象。,SNP只涉及單個(gè)堿基的變異，這種變異可以由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換（包括C與T互換，G與A互換），或顛換（包括C與A、G與T、C與G、A與T互換）引起。 點(diǎn)突變，位于密碼子的搖擺位置，表現(xiàn)為沉默突變而被大量保留下來(lái)。大多數(shù)不能被限制酶識(shí)別，必須采取測(cè)序或寡聚核苷酸雜交檢測(cè) 在人類(lèi)基因組中可達(dá)到300萬(wàn)個(gè)，平均每1000個(gè)堿基對(duì)就有一個(gè) 數(shù)目多，覆蓋密度大，被稱(chēng)為第三代分子標(biāo)記,根據(jù)SNP在基因中的位置，SNP可分為： 基因編碼區(qū)SNP（coding SNP, cSNP） 基因周邊SNP（peripheral S

21、NP, pSNP） 基因間SNP （intronicSNP, iSNP）,從對(duì)生物的遺傳性狀的影響，基因編碼區(qū)SNP cSNP又可分為兩種： 1.同義cSNP(synonymous cSNP)：SNP引起的編碼序列的改變并不影響其翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列; 2. 非同義cSNP（non-synonymous cSNP）：指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。,SNP標(biāo)記可用DNA芯片技術(shù)檢測(cè)：將不同的寡核苷酸固定在芯片上，標(biāo)記待測(cè)DNA，一次就可檢測(cè)很多SNP標(biāo)記。 盡管單一的SNP所提供的信息量遠(yuǎn)小于現(xiàn)在常用的

22、分子標(biāo)記，但SNP的數(shù)量極其豐富，并且可以自動(dòng)化檢驗(yàn)，因此其具有廣泛的應(yīng)用前景。 SNP數(shù)量比微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)要高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。,例如：34個(gè)SNP這種相鄰的界標(biāo)構(gòu)成的單倍型（haplotype）就可以有816種：,Haplotype:一條同源染色體上的等位基因或遺傳標(biāo)記所構(gòu)成的組合。,人類(lèi)不同群體中存在的SNP,SNP發(fā)生在全部人群的至少1%的人中。,大多數(shù)SNP位于非編碼序列，不影響基因功能。有些SNP位置靠近特定的基因，可作為基因的標(biāo)志。 其它的SNP位于編碼序列內(nèi)，可改變基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，從而影響人類(lèi)健康。,多肽鏈?zhǔn)怯砂被徇B接而成的。氨基酸具有不同的化學(xué)性質(zhì)。 多肽鏈須折疊成蛋白質(zhì)的立體

23、結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮正常的功能。如果多肽鏈中一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生了改變，則蛋白質(zhì)折疊和功能可能會(huì)發(fā)生改變。,有些SNP盡管位于編碼序列內(nèi)，但并不改變蛋白質(zhì)的組成。 例：CUG-CUC亮氨酸,有些SNP會(huì)給蛋白質(zhì)帶來(lái)微小而無(wú)害的影響。 例：GAUGAG 天東氨酸變成了谷氨酸。兩者都是酸性氨基酸。如果發(fā)生位置對(duì)蛋白質(zhì)功能影響不大，結(jié)果就是無(wú)害的。蛋白質(zhì)還會(huì)發(fā)揮正常的功能。,有些SNP會(huì)給蛋白質(zhì)的功能帶來(lái)有害的影響，稱(chēng)為變異。 例：GAUGUU 天東氨酸變成纈氨酸。由于化學(xué)性質(zhì)完全不同，會(huì)嚴(yán)重地影響到蛋白質(zhì)的折疊和功能。 鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥 血紅蛋白基因中單個(gè)堿基的改變導(dǎo)致谷氨酸被纈氨酸取代。變異的血紅蛋白

24、不能再攜氧，導(dǎo)致疾病。,有些SNP帶來(lái)的影響在一般情況下不顯現(xiàn)，只有在身體暴露在致病因子時(shí)才顯現(xiàn)。因?yàn)檫@些SNP所在的基因負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)有害因子的吸收，代謝，排泄等?；虻奈⑿∽兓瘯?huì)影響人體對(duì)疾病的易感性。 例：吸煙肺癌，過(guò)量飲酒肝癌。,當(dāng)人吸煙時(shí)，致癌因子的前體進(jìn)入肺部細(xì)胞內(nèi)。激活蛋白會(huì)將致癌因子的前體轉(zhuǎn)變成致癌因子。致癌因子會(huì)被解毒蛋白變成水溶性物質(zhì)并經(jīng)尿排出體外。,位于激活蛋白基因內(nèi)的SNP會(huì)影響激活蛋白的活性。 有些人的激活蛋白活性超強(qiáng)，可以在肺部產(chǎn)生大量的致癌因子，損害細(xì)胞的DNA導(dǎo)致癌癥。 有些人的激活蛋白活性超弱，產(chǎn)生的致癌因子較少，患癌癥的可能性較低。,SNP還會(huì)影響解毒蛋白的活性。

25、 有些人的解毒蛋白活性超強(qiáng)，可以很快將致癌因子排出體外?；及┌Y的可能性較低。 有些人的解毒蛋白活性超弱，將致癌因子排出體外的速度慢?；及┌Y的可能性較高。,在染料廠工作的工人會(huì)經(jīng)常接觸芳胺，患膀胱癌的可能性較高。 肝臟中有兩種酶可作用于芳胺。一種是解毒酶，將芳胺轉(zhuǎn)變成無(wú)毒物質(zhì)并排出體外。另一種是激活酶，可將芳胺轉(zhuǎn)變成致癌因子的前體，并轉(zhuǎn)運(yùn)至膀胱，可致膀胱癌。,SNP會(huì)影響解毒酶的活性。有些人的解毒酶活性較低，將芳胺轉(zhuǎn)變成無(wú)毒物質(zhì)的速度較慢。較多的芳胺會(huì)被轉(zhuǎn)變?yōu)橹掳┮蜃印＿@些人患膀胱癌的可能性較高。,療效及副作用的個(gè)體差異?？刂扑幬锏奈?，轉(zhuǎn)運(yùn)，代謝，排泄等環(huán)節(jié)的蛋白SNP。 例：將藥物轉(zhuǎn)變成有效

26、成分的蛋白及將藥物轉(zhuǎn)變成有毒副產(chǎn)物的蛋白。 解釋療效及副作用。,SNP數(shù)量眾多，穩(wěn)定及易于檢測(cè)。用作基因的標(biāo)記。 如SNP位于基因的附近并隨基因一起遺傳。發(fā)現(xiàn)了SNP就等于發(fā)現(xiàn)了基因。,科學(xué)家們正對(duì)很多人的基因組進(jìn)行大規(guī)模的測(cè)序，以找出所有的SNP，并繪制SNP的圖譜。,每個(gè)人都有他自己的SNP類(lèi)型。 根據(jù)SNP類(lèi)型將一個(gè)大的人群分為小的群體。,不同SNP類(lèi)型的人對(duì)治療的反應(yīng)不同。 將來(lái)，在確診后，根據(jù)患者SNP類(lèi)型來(lái)確定治療方法。,SNP類(lèi)型還有助于發(fā)現(xiàn)疾病基因。 只在疾病患者上發(fā)現(xiàn)的SNP是疾病基因的標(biāo)記。 有的SNP在基因附近，通過(guò)SNP可發(fā)現(xiàn)疾病基因。,SNP類(lèi)型還有助于發(fā)現(xiàn)患病的危險(xiǎn)

27、性。 例：在隨機(jī)抽取的100正常人中，80人有SNP A，20人有SNP B。而在100個(gè)腎癌患者中，60人有SNP A，40人有SNP B。 SNP B的人患腎癌的危險(xiǎn)性比SNP A的人高。,通過(guò)SNP圖譜，研究SNP與疾病易感性，治療有效性等的關(guān)系。 生活方式的干預(yù)（吸煙，飲酒）,選擇適當(dāng)療法。,2.3 遺傳作圖的方法,理論基礎(chǔ)：采用一組分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖 的方法主要依賴于連鎖分析。 基本方法：兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法和三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法,2.3 遺傳作圖的方法,連鎖分析是遺傳作圖的基礎(chǔ)：1905，Bateson，Saunder和Punnett首創(chuàng)；1911年Morgan揭示了連鎖分析的意義 在同一條染色體上的

28、基因間表現(xiàn)出遺傳連鎖(Genetic linkage)，因?yàn)樗鼈兌际窃谕粭l長(zhǎng)的DNA分子上 部分連鎖與重組： 比利時(shí)細(xì)胞學(xué)家Janssens發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂時(shí)同源染色體的交換 Sturtevant：2 個(gè)彼此靠近的基因之間因交換而分離的頻率，要比相互遠(yuǎn)離的2個(gè)基因之間發(fā)生分離的頻率要小 重組率則可成為測(cè)量基因之間相對(duì)距離的尺度，只要獲得不同基因之間的重組率，就可繪制一份基因位于染色體上相對(duì)位置的地理圖,部分連鎖與遺傳作圖,構(gòu)建遺傳圖譜的基本原理 真核生物遺傳過(guò)程中會(huì)發(fā)生減數(shù)分裂，此過(guò)程中染色體要進(jìn)行重組和交換，這種重組和交換的概率會(huì)隨著染色體上任意兩點(diǎn)間相對(duì)距離的遠(yuǎn)近而發(fā)生相應(yīng)的變化。 根據(jù)概率

29、大小，人們就可以推斷出同一條染色體上兩點(diǎn)間的相對(duì)距離和位置關(guān)系。 正因?yàn)槿绱耍覀兊玫降倪@張圖譜也就只能顯示標(biāo)記之間的相對(duì)距離。我們稱(chēng)這一距離(概率)為遺傳距離(cM)，由此構(gòu)建的圖譜也稱(chēng)為遺傳圖譜。,連鎖遺傳圖的做法,一般以最左端的基因位置為0，如發(fā)現(xiàn)有新的基因在更左端的位置時(shí)，把0點(diǎn)讓給新基因，其余的基因座位作相應(yīng)移動(dòng) 由于較遠(yuǎn)的兩基因之間發(fā)生偶數(shù)次交換，但沒(méi)有出現(xiàn)重組類(lèi)型，所以交換值要大于重組率。繪制連鎖遺傳圖時(shí)，需根據(jù)重組率進(jìn)行圖距的校正,遺傳圖的偏離,重組熱點(diǎn)：近端粒區(qū)、著絲點(diǎn)區(qū)特異基因區(qū)段（小鼠主要組織兼容性復(fù)合座位）性別影響：不同性別具有不同的重組熱點(diǎn),2.3.3 不同模式生物的

30、連鎖分析 連鎖分析分為3大范疇： 1. 有性雜交實(shí)驗(yàn) 2. 系譜分析 3. DNA轉(zhuǎn)移,雜交實(shí)驗(yàn)的連鎖分析,選擇已知基因型的親本，設(shè)計(jì)雜交方案，獲得交配的子代并分析其表型和基因型 對(duì)于高等真核生物的常規(guī)連鎖分析并不是直接檢查配子，而是檢測(cè)分別來(lái)自兩個(gè)親本配子融合形成的二倍體基因型，即進(jìn)行遺傳雜交 兩點(diǎn)雜交和多點(diǎn)雜交,兩點(diǎn)雜交：常用測(cè)交方法分析子代基因型分離比測(cè)交：雜合體X隱性純合體 子代表型逆推親代交換率,多點(diǎn)雜交：三個(gè)位點(diǎn)分析雙雜交,RFLP連鎖圖,RFLP是第一種用于研究的DNA標(biāo)記（David Bostein，1980） 基本設(shè)想：由于同源染色體同一區(qū)段DNA順序的差異，用限制酶消化時(shí)，

31、會(huì)得到長(zhǎng)度各不相同的限制性片段。經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離，可直接顯示不同個(gè)體同一位點(diǎn)DNA組成的差異 由于限制酶的專(zhuān)一性，用不同的限制酶處理同一DNA樣品時(shí)，可以產(chǎn)生與之對(duì)應(yīng)的不同限制性片斷，從而提供大量位點(diǎn)多態(tài)性信息,親本：A1/B1和A2/B2，個(gè)體231；新組合：A1/B2和A2/B1，個(gè)體39 交換率：39/（231+39）=14%；A與B相距14cM,RFLP原理圖示：,標(biāo)記1 標(biāo)記2,人類(lèi)遺傳圖譜的構(gòu)建系譜分析作圖,人類(lèi)不可能根據(jù)需要選擇親本，設(shè)計(jì)雜交組 合，構(gòu)建分離群體。 只能檢測(cè)現(xiàn)存家庭連續(xù)幾代成員的基因型。 家系分析法。 資料有限、必須借助于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。,系譜分析,系譜分析法即

32、對(duì)某家庭性狀相關(guān)成員進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)，分析性狀之間的連鎖關(guān)系，通過(guò)重組率進(jìn)行相關(guān)基因定位，這種方法又稱(chēng)家系分析法(pedigree method) 不能進(jìn)行有計(jì)劃的遺傳實(shí)驗(yàn)，只能收集家系成員的相關(guān)資料進(jìn)行連鎖分析，主要涉及人類(lèi)和多年生樹(shù)木 優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)值（lod score）分析：lod值是基因連鎖可能性的對(duì)數(shù)，用于判定所研究的兩個(gè)標(biāo)記是否在同一染色體上，換句話說(shuō)就是基因是否連鎖。如果優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)分析確定了連鎖，然后可以提供最可能的重組頻率程度。理想的情況是資料來(lái)自不同系譜,細(xì)菌的遺傳作圖,轉(zhuǎn)化（ transformation ）：供體細(xì)胞釋放的一段DNA（通常小于50kb），經(jīng)受體細(xì)胞攝取后整合到基因組中

33、，可借助抗性培養(yǎng)基篩選重組克隆 轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)：通過(guò)噬菌體將小片段DNA從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞 接合轉(zhuǎn)移(conjugation)：兩個(gè)細(xì)菌形成物理接觸，DNA從供體轉(zhuǎn)移到受體,細(xì)菌的遺傳重組,細(xì)菌遺傳作圖中采用的都是生化標(biāo)記（如合成色氨酸的能力、對(duì)抗生素的敏感性等），隱性表型（如不能合成色氨酸）是可以互補(bǔ)的性狀。 基因轉(zhuǎn)移在具有野生型等位基因的供體品系與具有隱性等位基因的受體品系之間進(jìn)行，根據(jù)受體細(xì)胞是否獲得基因指令的生化功能來(lái)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移的DNA是否進(jìn)入受體細(xì)胞 接合：根據(jù)野生型基因進(jìn)入受體的時(shí)間表，可以確定基因所在的位置 轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)化：依據(jù)所研究的基因是否同時(shí)出現(xiàn)在受體細(xì)胞

34、中，緊密連鎖的基因總是有最高的機(jī)率被同時(shí)轉(zhuǎn)移。,基因與分子標(biāo)記的共分離,共分離：如果限制酶多態(tài)性在基因組中自由發(fā)生，則有些會(huì)在特定基因附近產(chǎn)生。我們可以確定這樣的限制性標(biāo)記，因?yàn)樵摌?biāo)記與突變表型密切相關(guān)。如果比較患病者的和正常人的DNA 限制圖譜，可能發(fā)現(xiàn)一個(gè)特定的限制性位點(diǎn)通常出現(xiàn)(或者丟失)在患者DNA 中，原因是限制性標(biāo)記與表型間100%相關(guān)。它暗示限制性標(biāo)記與突變基因距離很緊，以至于它們?cè)谥亟M中不能分離,2.4 遺傳圖繪制,2.4.1 人類(lèi)遺傳圖 人類(lèi)解剖圖包括4張小圖，包括了人類(lèi)基因組計(jì)劃的全部主要內(nèi)容，它們分別是遺傳圖（連鎖圖）、物理圖、序列圖和轉(zhuǎn)錄圖 。 人類(lèi)遺傳圖有6000多個(gè)遺傳標(biāo)記作為路標(biāo)，把基因組分成6000多個(gè)區(qū)域，只要以連鎖分析的方法，找到某一表現(xiàn)型的基因與其中一種遺傳標(biāo)記鄰近（即緊密連鎖）的證據(jù)，就可以把這一基因定位于這一標(biāo)記所界定的區(qū)域內(nèi)。 這樣，如果想確定與某種已知疾病有關(guān)的基因，即可根據(jù)決定疾病性狀的位點(diǎn)與選定的遺傳標(biāo)記間的遺傳距離，來(lái)確定與疾病相關(guān)的基因在基因組中的位置。,人類(lèi)疾病基因研究,致病基因及相關(guān)基因的克隆在基因組學(xué)研究中占據(jù)著核心位置。 對(duì)疾病的預(yù)防，診斷，治療等有重要意義。 人類(lèi)基因組計(jì)劃的直接動(dòng)因是要解決包括腫瘤在內(nèi)的人類(lèi)疾病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)問(wèn)題。,