1、凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì),3,一、概述,蛋白質(zhì)是以氨基酸為最小構(gòu)成單元的大分子的含氮化合物，它是由20種氨基酸通過酰氨鍵以一定方式結(jié)合，并具有一定的空間結(jié)構(gòu)。,生理功能及在食品中的作用,5,常見食物中蛋白質(zhì)的含量,牛肉,螺旋藻,6,常見食物氮系數(shù),氮系數(shù)：蛋白質(zhì)含氮量的倒數(shù)，常用6.25表示。,7,蛋白質(zhì)測定方法,二、凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)（粗蛋白）,凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量。 1.原理,2.實(shí)驗(yàn)步驟,第一步：樣品消化,樣品與濃硫酸加熱消化，硫酸使有機(jī)物脫水并破壞有機(jī)物，C、H氧化為二氧化碳、水逸出，蛋白質(zhì)分解為氨、與硫酸結(jié)合生成硫酸銨、留在

2、溶液中,11,（1）消化 總反應(yīng)式：,消化裝置 “自動(dòng)回流消化儀”,定氮消化的不同狀態(tài),RCH2(NH2)COOH+H2SO4CO2+H2O+SO2+ (NH4）2SO4,澄清,消泡,碳化,消化過程中試劑作用,硫酸鉀：提高溶液沸點(diǎn)、加快反應(yīng)進(jìn)程； 硫酸銅（藍(lán)綠色）：催化作用,(NH4)2SO4+2NaOHNH3+Na2SO4+2H2O,第二步蒸餾,注意事項(xiàng)：,(3）吸收與滴定 吸收：加熱蒸餾所放出的氨，硼酸溶液 滴定：鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液， 硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.810-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用 硫酸、鹽酸溶液也可用作吸收劑。,18,各步驟操作細(xì)節(jié)圖解：,樣品消化

3、蒸餾滴定 （1）樣品消化,樣品+0.4g硫酸銅+6g硫酸鉀+20ml濃硫酸+玻珠數(shù)粒,先小火炭化，無泡沫后，加大火力，液體變藍(lán)綠透明，繼續(xù)加熱微沸30分鐘,45度角,消化終點(diǎn),瓶口不能對著人,蓋上小漏斗,19,（2）蒸餾,將消化液全部轉(zhuǎn)移 到100ml容量瓶中,加10ml硼酸溶液和混合指示劑23d,加入NaOH溶液后顏色為深藍(lán)色或褐色,通入蒸汽開始蒸餾,冷凝管下口浸入硼酸溶液中,取10ml消化稀釋液沿小玻璃杯移入反應(yīng)室，少量蒸餾水沖洗，塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內(nèi)加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH緩慢流入反應(yīng)室，立即塞緊玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。,20,吸收液變藍(lán)色后

4、繼續(xù)蒸餾5分鐘，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端，取下接收瓶，關(guān)閉電源,21,（3）滴定,取下接收瓶，用0.1000mol/L的鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。,滴定前,滴定終點(diǎn),同時(shí)做一試劑空白實(shí)驗(yàn)，記錄空白滴定消耗鹽酸的體積。,22,實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)消化,（1）不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶、緩和沸騰消化 （2）消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘，一般消化時(shí)間約4小時(shí) （3）可加如少量辛醇、硅油做消泡劑 （4）樣品不易澄清時(shí)可冷卻后加入30%過氧化氫2-3ml,小結(jié),24,25,自動(dòng)凱氏定氮儀法,在凱氏定氮法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的自動(dòng)凱氏定氮儀法，具有安全、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。 儀器：,消化

5、爐,自動(dòng)蒸 餾裝置,26,1、原理及適用范圍 2、特點(diǎn)： （1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。 （2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。 （3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。,雙縮脲法（分光光度法）,1.原理雙縮脲反應(yīng) 堿性條件下、雙縮脲與硫酸銅作用生成紫紅色配合物的反應(yīng)。 肽鍵（-CO-NH-）與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似、能呈現(xiàn)此反應(yīng)。 560nm處、由顏色深淺判定蛋白質(zhì)含量多少。,27,KOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉配置,標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線（standard curve）是指通過測定一系列已知組分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的某理化性質(zhì)，而得到的性質(zhì)的數(shù)值曲線。,R0.999方可使用,2.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制,（1）配置一定濃度（10mg/ml）的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液； （2）分別量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液于7支50ml比色管中； （3）向上述7支試管中分別加入1ml四氯化碳后、用堿性酒石酸銅溶液稀釋至50ml，振搖、靜止1h； （4）取上清液在2000r/