1、1,第四章抗菌藥物敏感試驗,主講人：,2,主 要 內(nèi) 容,抗菌藥物敏感性概述 抗菌藥物敏感性試驗方法 全國“細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)”簡介,3,敏感和耐藥的概念,從本質(zhì)上講：細(xì)菌對某種抗菌藥物是敏感還是耐藥，常以該抗菌藥物的治療濃度與MIC的關(guān)系而定。,常用劑量的抗菌藥物通過常用途徑所能達(dá)到的血藥濃度,4,血藥濃度與MIC之間的關(guān)系,敏感,中介耐藥,耐藥,上限,下限,5,抗菌藥物的治療濃度與MIC的關(guān)系： 若MIC小于治療濃度， 則為“敏感”（Sensitive , S ），推薦使用。 若MIC大于治療濃度， 則為“耐藥”（ Resistant , R ）； 若MIC介于治療濃度的上下限之間， 則為“中

2、度耐藥”（ Intermediate , I ）或中度敏感,敏感和耐藥的概念,6,7,敏感,治療濃度的上限即表中的 R,治療濃度的下限即表中的 S,耐藥,中介耐藥,治療濃度,CLSI標(biāo)準(zhǔn),MIC,8,第一節(jié)、抗菌藥物敏感性試驗方法,需氧和兼性厭氧菌,9,稀釋法 肉湯稀釋法（試管稀釋法） 瓊脂稀釋法（平板稀釋法） 紙片擴散法（紙片法） E-試驗 聯(lián)合藥物敏感試驗,需氧和兼性厭氧菌藥敏試驗的方法,10,稀釋法的特點,定量的藥敏試驗，測定MIC、MBC。 方法比較繁瑣，手工操作一般不作為常規(guī)試驗，常用于調(diào)查罕見耐藥。 自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)采用微量稀釋法檢測MIC。,11,二、紙片擴散法（dis

3、c diffusion test) （Kirby-Bauer法）,原理： 將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有測試菌的瓊脂平板上?？咕幬锵颦傊闹軘U散形成遞減的梯度濃度。 藥物敏感細(xì)菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長受到抑制，形成抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測試菌 對藥物的敏感程度。 二者呈正相關(guān)。,12,抑菌圈邊緣的藥物濃度 與 MIC,13,抑菌圈的大小與MIC： 二者呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。,14,紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑與結(jié)果解釋的標(biāo)準(zhǔn),15,操作方法 ： 1. 制備M-H瓊脂平板，厚度4mm。 2 .制備0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木?（培養(yǎng)1624h，45個菌落）。 3. 菌液均勻涂布于

4、平板。（15分鐘接種完畢） 4. 無菌貼標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片于M-H瓊脂表面， 5. 經(jīng)過351624h孵育。 6. 量取抑菌環(huán)直徑， 根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)， 報告細(xì)菌對該抗生素敏感、 耐藥、中介。,16,操作方法 ： 1. 將在約56恒溫的無菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm 的平板，其厚度 4mm。,17,2.無菌挑取孵育1624h的血平板上45個菌落。,18,3. 將菌置于無菌生理鹽水中，校正其濁度于0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木骸?1.5108CFU /ml,19,4.用無菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60）使菌液均勻分布，最后沿平板

5、內(nèi)緣涂抹一周。,20,5.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置310分鐘后貼上標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片。,21,6.用無菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動；各抗菌紙片中 心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。,22,7.經(jīng)過351624h孵育。,8.取抑菌環(huán)直徑， 根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，報告細(xì)菌對該抗生素敏感、耐藥、中介。,23,紙片擴散法質(zhì)量控制,培養(yǎng)基：M-H平板厚度，4 mm 細(xì)菌懸液：0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌濃度 藥敏紙片的質(zhì)量 各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm， 紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。 9cm的平板貼6個 培養(yǎng)時間 質(zhì)控菌株,抑菌圈直徑？

6、,24,25,根據(jù)抑菌圈的直徑，依照CLSI標(biāo)準(zhǔn)，作出敏感、耐藥、和中介的判斷。為 定性”結(jié)果。 CLSI推薦的最簡單的藥敏試驗。,紙片擴散法的特點,26,三、E試驗法（濃度梯度法）,原理： E試條是一條5mm50mm無孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的濃度呈連續(xù)指數(shù)增長的抗菌藥物，另一面有判別的刻度?？咕幬锏奶荻瓤筛采w有15-20個對倍稀釋濃度的寬度范圍。 將E試條放在細(xì)菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的MIC。 依照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感、耐藥、中介。,256 128 8 016,27,無菌生長區(qū),有菌生長區(qū)

7、,28,橢圓形細(xì)菌生長抑制區(qū),256 128 8 016,判讀抑菌濃度 （MIC ug/ml),29,30,31,E test 法特點,優(yōu)點 連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關(guān)性好（相關(guān)系數(shù)為0.9）.可測MIC。 操作簡單，影響因素少，穩(wěn)定性高。 缺點：E試條較昂貴; 不適用于生長緩慢的苛養(yǎng)菌。,32,用于病原菌尚未確定的急、重癥感染的經(jīng)驗治療,以擴大病原治療的覆蓋面 治療多種細(xì)菌所引起的混合感染 對于某些耐藥菌可取得協(xié)同抗菌作用 減少或推遲治療過程中細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生 避免藥物達(dá)到毒性劑量。,四、聯(lián)合藥物敏感試驗,聯(lián)合藥物意義,33,增強作用：兩種抗生素聯(lián)用的效果大于它們單獨使用時的效果之和；

8、2025 相加作用：它們聯(lián)用時的效果等于單用兩種抗生素效果之和； 6070 無關(guān)作用：兩種抗生素聯(lián)用的效果，僅相當(dāng)于其中一種具有較強作用的抗生素的效果； 拮抗作用：兩種抗生素聯(lián)用時的效果反而小于它們分別使用時的效果之和。 1015,兩種藥物的聯(lián)合使用的效果,34,兩種抗菌藥物作用部位不同： 內(nèi)酰胺類抗生素（抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成）與氨基糖苷類抗生素（干擾細(xì)菌的代謝）。 增強作用：增加了藥物進入細(xì)菌細(xì)胞 桿菌肽（降低細(xì)胞通透性）與氨基糖苷類藥物（干擾細(xì)菌的代謝）。 拮抗作用：降低了藥物進入細(xì)菌細(xì)胞,抗菌藥物協(xié)同作用發(fā)生原理,35,棋盤稀釋法 利用肉湯稀釋法原理，依據(jù)兩種藥物的MIC， 以棋盤設(shè)計兩種

9、藥物不同濃度的組合。 計算抑菌濃度指數(shù)（fraction inhaibitory concentration,FIC),聯(lián)合藥物敏感試驗方法,36,棋盤稀釋法,首先分別測定擬聯(lián)合的抗菌藥物對檢測菌的MIC。 藥物最高濃度為MIC的2倍，對倍稀釋。 兩種藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進行，這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種藥物混合液。 接種菌量為5105CUFml，35孵育18h后觀察結(jié)果。 計算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)。,37,抑菌濃度指數(shù)（FIC）,FIC ,A藥聯(lián)合時的MIC,A藥單測的MIC,B藥聯(lián)合時的MIC,B藥單測的MIC,FIC 0.5為協(xié)同作用； 0.51為相加作用

10、； 12為無關(guān)作用； 2 為拮抗作用,38,A藥： 32 16 8 4,B藥: 16 8 4 2,生長,生長,生長,生長,生長,生長,生長,生長,生長,生長,生 長,39,藥敏試驗方法的比較,K-B法： WTO推薦使用的最簡單的定性藥敏試驗。 稀釋法：準(zhǔn)確測定MIC、 MBC，比較繁瑣， 試管法一般不作為常規(guī)試驗。 微生物自動分析系統(tǒng)采用微量稀釋法原理。 E試驗：可測定MIC。,40,第二節(jié) 結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗 （了解）,首次分離的分枝桿菌需做藥敏試驗，有助于合理用藥和監(jiān)測藥物敏感性。 另外經(jīng)過三個月正規(guī)治療，標(biāo)本分離培養(yǎng)仍為陽性患者，或感染的嚴(yán)重疾患（如播散性結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎）。 以

11、及來自高耐藥流行區(qū)的患者，均須做體外藥敏試驗。,41,四種方法,比例法 放射同位素法 絕對濃度法 耐藥率法,直接法：直接采用圖片陽性的體液標(biāo)本。（須經(jīng)充分消化五雜菌） 間接法：經(jīng)分離純培養(yǎng)后的次代培養(yǎng)菌。,42,無藥,藥2,藥3,藥1,Middlebrook7H10瓊脂 培養(yǎng)3周,間接比例法（WHO推薦）,敏感：含藥格無結(jié)核桿菌生長， 或菌落數(shù)1%對照格 耐藥：含藥格菌落數(shù)1%對照格。,不含藥的對照格菌落數(shù)應(yīng)為50150,4 格平板,43,分枝桿菌微量直視 快速藥敏試驗法,4000 倍,44,培養(yǎng)72h觀察結(jié)果,INH敏感,RFP耐藥,陽性對照,陰性對照,45,第三節(jié) 厭氧菌體外藥敏試驗 （了

12、解）,厭氧菌感染多為內(nèi)源性感染，厭氧菌藥物敏感性穩(wěn)定，一般不做體外藥敏試驗。 下述情況應(yīng)考慮藥敏試驗： 明確厭氧菌引起的嚴(yán)重感染； 已確證的厭氧菌感染，經(jīng)驗性選藥治療未能奏效； 需長期用藥的厭氧菌感染。,46,基本原理和方法與需氧菌相同，只是在培養(yǎng)基、操作環(huán)境和培養(yǎng)條件等應(yīng)根據(jù)厭氧菌的特定需要變動。 培養(yǎng)基為布氏血瓊脂再加人補充劑 5g/ml氯化血紅素，5脫纖維羊,1g/ml Vit K。 厭氧孵育條件 質(zhì)控菌株為脆弱類桿菌ATCC25285。,厭氧菌體外藥敏試驗,47,藥敏試驗結(jié)果的臨床價值,影響抗菌藥物臨床療效的因素很多，據(jù)報道藥敏試驗結(jié)果與臨床療效的符合率約為70% ， 因此細(xì)菌培養(yǎng)及藥

13、敏試驗報告只能作為臨床用藥的參考，應(yīng)根據(jù)患者用藥后的治療反應(yīng)和臨床病情及時調(diào)整用藥。 醫(yī)學(xué)檢驗的靈魂是與臨床溝通。,48,新的藥敏試驗方法探索,流式細(xì)胞術(shù)檢測抗生素最低抑菌濃度 分枝桿菌藥物最低抑菌濃度的快速測定方法研究,49,細(xì)菌耐藥性的發(fā)生過程：,細(xì)菌獲得與耐藥相關(guān)的基因 編碼與耐藥有關(guān)的蛋白 表現(xiàn)出對某種抗生素的耐藥,基因：537 表型：書533頁 敏感性,50,第35章第三節(jié)細(xì)菌耐藥性檢測,51,生物化學(xué)技術(shù)檢測酶的等電點(等電聚焦電泳) 頭孢哨噻吩濾紙片法 碘淀粉測定法 分析酶的底物譜及抑制物譜 紙片法和稀釋法,1、-內(nèi)酰胺酶檢測,臨床意義：產(chǎn)ESBL克雷伯菌和大腸埃希菌對青霉素、頭

14、孢菌素和氨曲南治療無效。,一、耐藥表型檢測,52,G-菌產(chǎn)生的頭孢菌素酶檢測 -頭孢哨噻吩濾紙片法,用接種環(huán)挑取受試菌于頭孢哨噻吩（產(chǎn)色頭孢菌素）濾紙片上(商品化)， 10分鐘內(nèi)由淺黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色即陽性結(jié)果， 表示頭孢菌素的-內(nèi)酰胺環(huán)被酶打開。 臨床意義：產(chǎn)生該酶的細(xì)菌對頭孢菌素類抗生素耐藥。,53,G+菌產(chǎn)生的青霉素酶檢測 -碘淀粉測定法,受試菌混于青霉素溶液，振搖30分鐘。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液變藍(lán)，繼續(xù)振搖。 10分鐘之內(nèi)藍(lán)色消失者為產(chǎn)酶株。,青霉素酶,青霉素,青霉素噻唑酸,碘,碘淀粉復(fù)合物變?yōu)闊o色,多為金黃色葡萄球菌產(chǎn)生，對青霉素G耐藥。,54,超廣譜-內(nèi)酰胺酶Extende

15、d-Spectyum-Lactamase，ESBL ESBLs,能水解青霉素類，頭孢菌素和氨曲南。 不能水解碳青烯酶類，如亞胺培南 多數(shù)可被內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。 如為ESBL陽性，則對青霉素類，頭孢菌素和氨曲南均報告耐藥，不考慮體外藥敏結(jié)果。,55,常見產(chǎn)ESBLs菌株,最常見是腸桿菌科細(xì)菌（大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌）； 其次，陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、弗勞地枸櫞酸菌、銅綠假單胞菌、奈瑟菌等。,56,ESBLs的臨床意義,對產(chǎn)ESBLs菌株，目前最有效的抗生素為碳青霉烯類（泰能），其次，頭孢西丁及含酶抑制劑的復(fù)合劑、氨基糖甙類部分有效。 若臨床出現(xiàn)產(chǎn)ESB

16、Ls菌株，會在病人和醫(yī)院之間及不同菌株間相互傳播，應(yīng)引起充分的重視。,57,紙片初篩： 培養(yǎng)基：Muller-Hinton瓊脂 藥敏紙片 接種：按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴散法 孵育： 35大氣環(huán)境，16-18小時 結(jié)果： 頭孢泊肟（10ug片）抑菌環(huán)22mm 頭孢他啶（10ug片）抑菌環(huán)22mm 氨曲南 （30ug片）抑菌環(huán)27mm 頭孢噻肟（30ug片）抑菌環(huán)27mm 頭孢曲松（30ug片）抑菌環(huán)25mm,超-內(nèi)酰胺酶檢測紙片擴散法,ESBLs的底物,可能產(chǎn)生ESBLs,58,培養(yǎng)基：Muller-Hinton瓊脂 藥敏紙片濃度： 頭孢噻肟30ug、頭孢噻肟/克拉維酸30ug/10ug 頭孢他啶30ug、

17、頭孢他啶/克拉維酸30ug/10ug 接種：按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴散法 孵育：35大氣環(huán)境，16-18小時 結(jié)果：復(fù)合制劑藥物紙片的抑菌圈直徑 比非復(fù)合制劑藥物紙片的直徑 5mm 以上者為產(chǎn)ESBLs菌。,ESBLs的底物 ESBLs的抑制劑,(1)紙片確證試驗：,59,混合克拉維酸藥物紙片,無克拉維酸藥物紙片的直徑,直徑差5 mm ：ESBL,60,篩選試驗： 選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松至少2種以上， 用標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法稀釋至1g/ml, 凡被測菌在上述各管中能夠生長(MIC2g/ml)，高度懷疑為ESBLs，應(yīng)進一步作確認(rèn)試驗來加以確診。,（2）液體稀釋法,61,確認(rèn)試驗： 用

18、標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法測定MIC的方法, 頭孢噻肟單獨稀釋(0.2564g/ml)及 頭孢噻肟(稀釋范圍相同)加克拉維酸(每管4g/ml); 頭孢他啶單獨稀釋(0.25128g/ml)及 頭孢他啶加克拉維酸(每管4g/ml), 上述2種藥物必須同時進行試驗, 結(jié)果加克拉維酸和不加克拉維酸的 MIC差值8倍(3個稀釋度)，可確認(rèn)為ESBLs菌株。,（2）液體稀釋法,62,二、細(xì)菌耐藥基因檢測,基因檢測方法檢測細(xì)菌耐藥性的優(yōu)缺點 抗生素耐藥性的基因檢測方法 基因檢測方法的應(yīng)用,63,基因檢測細(xì)菌耐藥性的優(yōu)點：,能早期指導(dǎo)臨床醫(yī)生治療用藥。 分子遺傳學(xué)方法可以直接從臨床標(biāo)本入手，無需菌株的培養(yǎng)，極大地節(jié)省時

19、間 ， 減輕實驗室生物危險性。 有助鑒別那些處于中介水平或常規(guī)藥敏結(jié)果模棱兩可的結(jié)果。分子生物學(xué)方法被認(rèn)為是“ 金標(biāo)準(zhǔn)” 。 在細(xì)菌耐藥性的流行病追蹤調(diào)研中，耐藥基因檢測比抗生素敏感方法更準(zhǔn)確。 發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因。,64,基因檢測方法檢測抗生素耐藥性的缺點：,當(dāng)樣品中菌量很少時，其敏感性會大大降低。 對每一個測試的抗菌藥物，均需要設(shè)計相應(yīng)的分子檢測方法，一次只能檢測一種耐藥機制。 目前仍有許多耐藥機制是未知的，無法進行分子檢測。 耐藥基因的檢測也會存在假陽性問題。 對許多耐藥基因的檢測方法，目前還缺乏臨床對照研究以評價其準(zhǔn)確性、重復(fù)性及臨床應(yīng)用價值。,65,常見的細(xì)菌耐藥相關(guān)基因舉例,66,耐

20、藥基因檢測方法：,分子方法檢測耐藥基因的基礎(chǔ)是 PCR。 在 PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的方法： 分子雜交、 DNA序列分析， 基因微振列技術(shù)等。,67,PCR-序列特異性引物擴增耐藥基因,標(biāo) 本,提取DNA,PCR擴增目的基因DNA,瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果分析,1 2 3 4,1 2 3 4,耐藥基因的的特異性引物,理想的靶序列應(yīng)當(dāng)是耐藥基因的編碼區(qū)域，而非編碼區(qū)外的基因( 如插入序列或啟動子序列) 。 特異性高，需要設(shè)立陰性對照。,68,基因芯片技術(shù),芯片制備：以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。 樣品制備：生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。 雜交反應(yīng)：即熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進行反應(yīng)產(chǎn)生一系列