1、中藥新藥安全性評價技術(shù)與方法,毒理學(xué) 藥物毒理學(xué) 新藥安全性評價 中藥新藥急性毒性試驗 中藥新藥長期毒性試驗 中藥新藥一般藥理學(xué)試驗 中藥注射劑過敏、刺激、溶血性試驗 其他,中藥新藥注冊分類,1、未在國內(nèi)上市銷售的從植物、動物、礦物等物質(zhì)中提取的有效成分及其制劑。 2、新發(fā)現(xiàn)的藥材及其制劑。 3、新的中藥材代用品。 4、藥材新的藥用部位及其制劑。 5. 未在國內(nèi)上市銷售的從植物、動物、礦物等物質(zhì)中提取的有效部位及其制劑 國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中未收載的從單一植物、動物、礦物等物質(zhì)中提取的一類或數(shù)類成份組成的有效部位及其制劑，其有效部位含量應(yīng)占提取物的50以上。 6. 未在國內(nèi)上市銷售的中藥、天然藥物復(fù)方

2、制劑 6.1中藥復(fù)方制劑； 6.2天然藥物復(fù)方制劑； 6.3中藥、天然藥物和化學(xué)藥品組成的復(fù)方制劑。 7、改變國內(nèi)已上市銷售中藥、天然藥物給藥途徑的制劑。 8、改變國內(nèi)已上市銷售中藥、天然藥物劑型的制劑 9、已有國家標(biāo)準(zhǔn)的中藥、天然藥物。,藥品屬性三原則 安全性 有效性 質(zhì)量穩(wěn)定可控,中藥、天然藥物申報資料：綜述資料,1、藥品名稱。 2、證明性文件。 3、立題目的與依據(jù)。 4、對主要研究結(jié)果的總結(jié)及評價。 5、藥品說明書樣稿、起草說明及最新參考文獻(xiàn)。 6、包裝、標(biāo)簽設(shè)計樣稿。,中藥、天然藥物申報資料：藥學(xué)研究資料,7、藥學(xué)研究資料綜述。 8、藥材來源及鑒定依據(jù)。 9、藥材生態(tài)環(huán)境、生長特征、形

3、態(tài)描述、或培植（培育）技術(shù)、產(chǎn)地加工和炮制方法 10、藥材標(biāo)準(zhǔn)草案及起草說明，并提供藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及有關(guān)資料。 11、提供植、礦物標(biāo)本，植物標(biāo)本應(yīng)當(dāng)包括花、果實、種子等。 12、生產(chǎn)工藝的研究資料及文獻(xiàn)資料，輔料來源及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。,中藥、天然藥物申報資料：藥學(xué)研究資料,13、確證化學(xué)結(jié)構(gòu)或組分的試驗資料及文獻(xiàn)資料。 14、質(zhì)量研究工作的試驗資料及文獻(xiàn)資料。 15、藥品標(biāo)準(zhǔn)草案及起草說明，并提供藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及有關(guān)資料。 16、樣品檢驗報告書。 17、藥物穩(wěn)定性研究的試驗資料及文獻(xiàn)資料。 18、直接接觸藥品的包裝材料和容器的選擇依據(jù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。,中藥、天然藥物申報資料：藥理毒理研究,19、藥理毒理研究

4、資料綜述。 20、主要藥效學(xué)試驗資料及文獻(xiàn)資料。 21、一般藥理研究的試驗資料及文獻(xiàn)資料。 22、急性毒性試驗資料及文獻(xiàn)資料。 23、長期毒性試驗資料及文獻(xiàn)資料。 24、過敏性（局部、全身和光敏毒性）、溶血性和局部（血管、皮膚、粘膜、肌肉等）刺激性、依賴性等主要與局部、全身給藥相關(guān)的特殊安全性試驗資料和文獻(xiàn)資料。 25、致突變試驗資料及文獻(xiàn)資料。 26、生殖毒性試驗資料及文獻(xiàn)資料。 27、致癌試驗資料及文獻(xiàn)資料。 28、動物藥代動力學(xué)試驗資料及文獻(xiàn)資料 。,中藥、天然藥物申報資料：臨床試驗資料,29、臨床試驗資料綜述。 30、臨床試驗計劃與方案。 31、臨床研究者手冊。 32、知情同意書樣稿、

5、倫理委員會批準(zhǔn)件。 33、臨床試驗報告。,急性毒性試驗：動物單次或24小時內(nèi)多次接受一定劑量的受試物，動物在一定時間內(nèi)出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。 急性毒性試驗主要包括： 半數(shù)致死量（LD50）試驗 最大給藥量試驗 最大耐受量試驗 近似致死劑量試驗,一、中藥新藥急性毒性試驗,定性觀察：包括動物體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、動物異常反應(yīng)的癥狀、起始時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間、是否可逆以及動物死亡情況 定量指標(biāo)： 半數(shù)致死量（LD50） 近似致死劑量（ALD） 最大耐受量（MTD） 最大給藥量,實驗方法與結(jié)果,受試物 受試物采用制備工藝穩(wěn)定、符合臨床試用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的中試樣品，注明名稱、提供單位、

6、批號、性狀、含量、劑型、配制方法、保存條件等。 如不采用中試樣品，應(yīng)有充分的理由。 若由于給藥容積或給藥方法限制，可采用原料藥進(jìn)行試驗,試驗動物 1，5類藥至少必須用2種動物（嚙齒和非嚙齒） 一般采用嚙齒類和/或非嚙齒類動物，雌雄各半，所用動物應(yīng)符合國家有關(guān)藥物非臨床安全性研究的要求。 如臨床為單性別用藥，可采用相對應(yīng)的單一性別的動物。 如受試物擬用于兒童，建議考慮采用幼年動物。 中毒反應(yīng)或死亡率與動物的性別有明顯相關(guān)時，應(yīng)選擇性別敏感的動物進(jìn)行復(fù)試。,試驗分組 按性別、體重采用分區(qū)隨機(jī)法分組 除受試物不同劑量組外，還應(yīng)設(shè)空白(和/或陰性)對照組。充分對照 給藥途徑須與臨床擬給藥途徑一致，若不

7、同應(yīng)充分說明理由；根據(jù)新藥研究技術(shù)指南，需要進(jìn)行兩種給藥途徑試驗的受試物，如臨床為非血管內(nèi)給藥，另一給藥途徑采用靜脈給藥方式；如果因為制劑等原因不能采用靜脈給藥，應(yīng)充分說明理由。,給藥容量 經(jīng)口給藥前動物禁食不禁水過夜，大鼠給藥容量每次一般不超過20ml/kg，小鼠每次一般不超過40ml/kg。 觀察期限一般觀察14天，如觀察時間不足14天，應(yīng)充分說明理由。,觀察指標(biāo) 應(yīng)定期記錄動物的體重及耗食量。如有異常情況，應(yīng)跟蹤觀察。 給藥當(dāng)天，尤其是給藥后4h內(nèi)應(yīng)嚴(yán)密觀察記錄，然后每天上、下午各觀察1次，連續(xù)14天，包括動物體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、動物異常反應(yīng)的癥狀、起始時間、嚴(yán)重

8、程度、持續(xù)時間、是否可逆以及動物死亡情況。 剖檢：死亡動物應(yīng)及時進(jìn)行尸檢，其他動物在觀察期結(jié)束后(給藥第15天)，進(jìn)行大體解剖，記錄病變情況，當(dāng)發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時則須進(jìn)行病理檢查并記錄。,半數(shù)致死量的測定 劑量設(shè)定：根據(jù)預(yù)試結(jié)果所獲得的0和100致死量范圍內(nèi)選用幾個劑量進(jìn)行試驗，分46個劑量組，組距設(shè)計一般為0.650.85。 用Bliss的方法求出LD50值及95%的可信區(qū)間，各劑量組的死亡率。若毒性反應(yīng)有明顯的性別差異，應(yīng)求出不同性別的LD50。詳細(xì)報告試驗過程中動物出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)及致死癥狀，綜合評價受試物毒性大小。,最大耐受量的測定 劑量設(shè)定：根據(jù)預(yù)試結(jié)果在動物死亡的劑

9、量下按等比級數(shù)設(shè)劑量組，可分25個劑量組，組距設(shè)計一般為0.650.85。最大劑量應(yīng)有動物死亡，死亡率小于50。 詳細(xì)報告試驗過程中動物出現(xiàn)的異常表現(xiàn)及致死癥狀，計算出動物總給予藥量g/kg（或以含生藥量g/kg表示），即動物的最大耐受量，評價受試物毒性情況。,最大給藥量的測定 劑量設(shè)定：以允許并合理的最大濃度、最大容量單次或一日內(nèi)23次給予動物。 體重：雌雄分別進(jìn)行組間比較。 詳細(xì)報告試驗過程中動物出現(xiàn)的異常表現(xiàn)，計算出動物總給藥量g/kg（或以含生藥量g/kg表示），即動物的最大給藥量，推算出相當(dāng)于臨床擬用藥量的倍數(shù)，評價受試物毒性大小。,犬急性毒性試驗(近似致死劑量法）,動物試驗前隔夜禁

10、食不禁水，根據(jù)小動物毒性實驗，參照藥物臨床實驗治療使用量，估計可能引起毒性反應(yīng)和死亡的劑量范圍，按50%遞增法，設(shè)計出含10-20個劑量序列表。 以最大給藥劑量預(yù)實驗一條犬，根據(jù)情況完成下列步驟： 若出現(xiàn)死亡或明顯毒性反應(yīng)，由劑量序列表中找出可能的致死劑量范圍，在此范圍內(nèi)，每間隔一個劑量染毒一只動物，測出最低致死劑量和最高非致死劑量，然后用兩者之間的劑量染毒一只動物，則此劑量即為近似致死劑量。 若沒有死亡或沒有出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，則按照最大給藥劑量實驗放樣觀察藥物的可能毒性反應(yīng)。 同時平行實驗作為對照組。,檢測指標(biāo) 常規(guī)觀察 1 中毒表現(xiàn)：犬給藥后密切觀察4個小時。此后每天上、下午各觀察一次，

11、連續(xù)觀察14天。觀察動物的體重變化、飲食、行為、分泌物、排泄物等，并記錄中毒死亡時間，中毒反應(yīng)起始時間、持續(xù)時間、恢復(fù)期是否可逆，動物最短死亡時間，最長死亡時間，平均死亡時間等，報告近似致死劑量和最大耐受劑量。 2 剖 檢：動物死亡應(yīng)及時剖檢，其他動物在觀察期結(jié)束后進(jìn)行大體解剖，記錄病變情況，主要觀察心臟、肺臟、腎臟、肝臟、脾臟、胃腸道等內(nèi)臟，觀察是否有出血點(diǎn)、水腫等異常情況，并作書面記錄。當(dāng)發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時須進(jìn)行病理檢查。 對于創(chuàng)新藥物，還可進(jìn)行以下指標(biāo)檢測（體重、攝食量、體溫、心電圖等指標(biāo)可酌情增加12次檢測）。,二、中藥新藥長期毒性試驗,對動物反復(fù)多次連續(xù)給藥的毒性試

12、驗 試驗的目的 1、反復(fù)多次給藥的情況下，實驗動物 出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、量效關(guān)系、主要的靶器官、損害程度及其可逆性。 2、獲得反復(fù)給藥情況下，實驗動物能 耐受的劑量范圍及無毒性反應(yīng)的安全范圍。,一般藥物的長期毒性研究給藥期限表,動 物 SPF級SD或Wistar健康大鼠，一般每組1030只（若藥物毒性大，或試驗周期為6個月，每組應(yīng)增加10只動物）， 69周齡，動物體重差異應(yīng)在平均體重的20%之內(nèi)，應(yīng)有動物質(zhì)量合格證書。 試驗周期3個月以上可選56周齡大鼠。 每組雌雄各半，雌性應(yīng)未孕。如臨床為單性別用藥，應(yīng)采用相應(yīng)的單一性別的動物。,飼養(yǎng)管理 飼料應(yīng)有合格證，寫明供應(yīng)單位、批號、檢測報告等。 動物飼

13、養(yǎng)應(yīng)在取得實驗動物使用許可證的動物房內(nèi)進(jìn)行。 大鼠每籠不宜超過5只，雌雄分籠飼養(yǎng)。 試驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)，一般觀察57天，應(yīng)作好觀察記錄。,受試物 受試物一般為中試樣品，應(yīng)和藥效、一般藥理、急性毒性、藥代動力學(xué)研究用藥有相同的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進(jìn)行試驗。 應(yīng)有受試物名稱或代號、提供單位、批號、保存條件、使用注意事項等。 溶媒或賦形劑要注明批號、提供單位等。,分 組一般設(shè)高、中、低三個劑量組和對照組，對照組則給予相應(yīng)的溶媒或賦形劑；若溶媒或賦形劑有毒性，則應(yīng)增設(shè)空白對照組（蒸餾水）。,給 藥 1 給藥途徑 1.1 一般要求與臨床給藥途徑一致，若不同則充分說明理由。

14、 1.2 口服可采用直接灌胃給藥。 1.3 臨床靜脈注射的藥物采用靜脈注射給藥，特殊情況另作說明。,大鼠長期毒性試驗劑量設(shè)計 低劑量原則上應(yīng)高于動物藥效學(xué)試驗的等效劑量或預(yù)期的臨床治療劑量的等效劑量。高劑量原則上應(yīng)使動物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)，甚至可引起少數(shù)動物死亡。高、低劑量組之間應(yīng)再設(shè)一個中劑量組。 對中藥復(fù)方或其他特殊情況下，可采用長毒可允許的最大濃度和最大劑量作為高劑量。,劑量設(shè)計參考方法 臨床劑量法：中藥、天然藥物的復(fù)方制劑多根據(jù)擬推薦臨床劑量決定，一般3個月以上長期毒性，大鼠高劑量組原則上應(yīng)使動物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)，甚至可引起少量動物死亡。低劑量組原則上應(yīng)高于動物藥效學(xué)試驗的等效劑量或

15、預(yù)期的臨床治療劑量的等效劑量。高、低劑量組之間再設(shè)一個中劑量組。此為最常采用的方法。 最大耐受量法（MTD）：新藥研究可參考國外文獻(xiàn)資料或最大耐受量決定。用一個最大耐受量（MTD）、1/3MTD、1/10MTD分別為大鼠長期毒性試驗的高、中、低三個劑量。 最大濃度法：對毒性較低的中藥可采用最大濃度法，以藥物可進(jìn)行順利灌胃的濃度作為高劑量組的給藥濃度。,給藥容量：給藥容量一般為11.5ml/100g體重/次（若每天給藥23次，每次給藥容量可酌情減少），每周可根據(jù)體重情況調(diào)整給藥量，一般以不等濃度等容量給藥。 給藥頻率：試驗周期3個月，每周7天連續(xù)給藥；3個月，可考慮每周給藥6天，每天給藥時間應(yīng)盡

16、量保持一致。,檢測指標(biāo),一般觀察 外觀體征和行為活動，流涎等腺體分泌、糞便性狀與顏色、毛色、行為、給藥局部反應(yīng)、食量及體重變化。對死亡動物應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)病理學(xué)檢查。,血液學(xué)指標(biāo)(10項),紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù) 血紅蛋白 血液學(xué)指標(biāo) 白細(xì)胞總數(shù)及分類 血小板 凝血時間,血液生化學(xué)指標(biāo)（15-16項）,天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST) 丙氨酸氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT) 堿性磷酸酶(ALP) 血液生化 尿酸氮(BUN) 、總蛋白(TP) 主要指標(biāo) 白蛋白(Alb) 、血糖(ALU) 總膽紅素(TB)、肌酐(Cr) 總膽固醇(TC) -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（非嚙齒類動物）,特殊檢查,可能引起眼、耳毒性的藥物，應(yīng)增加

17、眼及耳毒性的檢查。 有些藥物尚需研究對酸堿平衡、水鹽代謝的影響。,系統(tǒng)尸體解剖,臟器系數(shù)（10個）：心、肝、脾、肺、腎、 腎上腺、胸腺、睪丸、 附睪、子宮、卵巢、腦 組織病理學(xué)檢查（34項） 腦、脊髓、視神經(jīng)、眼、垂體、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、睪丸、子宮等。,注意事項 大鼠在解剖與取血前禁食不禁水過夜。 采血順序：對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組各取一只，依次重復(fù)循環(huán) 血清標(biāo)本應(yīng)避光保存。 需要保存的血清，可在46的冰箱中保存7天備用。7天后應(yīng)放在-70冷凍保存。 低溫下保存的標(biāo)本不能在室溫慢慢溶解，而應(yīng)放在2537水浴中短時間快速溶解，充分混勻。 標(biāo)本應(yīng)避免重復(fù)的凍結(jié)溶解，以

18、免標(biāo)本成分變化。 采集的樣本異常，應(yīng)予以記錄。,檢測時間：應(yīng)于給藥終期及恢復(fù)期結(jié)束時進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，或于給藥中期增加1次指標(biāo)檢測。 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計：體重、耗食量、臟器指數(shù)依雌雄分別進(jìn)行組間比較。,結(jié)果與分析 注意毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時間、恢復(fù)時間及動物死亡時間。 對所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行全面和科學(xué)的分析，對在背景數(shù)據(jù)范圍以外的各實測值應(yīng)在試驗結(jié)果中詳細(xì)列出，并予以合理的分析。 應(yīng)正確理解均值數(shù)據(jù)和單個數(shù)據(jù)的意義，并注重個體分析，同時結(jié)合其它相關(guān)安全性試驗及藥代/毒代動力學(xué)的結(jié)果進(jìn)行分析。綜合考慮數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義。 試驗報告：試驗報告應(yīng)全面客觀反映整個試驗過程收集的原始資料和信息。,犬長期毒性

19、觀察指標(biāo),一般狀況觀察 每天根據(jù)體重給藥并填寫給藥記錄表 應(yīng)觀察包括犬外觀體征、行為活動、惡心嘔吐、腺體分泌、呼吸、糞便、尿液（11項）、攝食量、體重、給藥局部及眼科反應(yīng)等。 每天應(yīng)觀察記錄犬的一般狀況，填寫觀察表。 每周應(yīng)固定時間測量1次犬體重及攝食量。 心電圖 檢查指標(biāo)：導(dǎo)聯(lián)心律、心率；PR間期、QT間期、QRS波群、T波等。 眼科檢查 指標(biāo)：角膜是否渾濁。虹膜有無充血、腫脹。結(jié)膜有無充血、水腫及分泌物。瞳孔對光反射是否正常，必要時檢查眼底血管是否正常。檢查結(jié)果記錄在附表-2“其他情況”內(nèi)。觀察到有異常情況時詳細(xì)記錄。. 血液學(xué)指標(biāo) 應(yīng)觀察紅細(xì)胞計數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞計數(shù)及

20、分類、血小板、凝血酶原時間等，必要時做骨髓涂片檢查。,犬長期毒性觀察指標(biāo),系統(tǒng)尸解 大體解剖：系統(tǒng)尸檢應(yīng)全面細(xì)致，解剖過程同大鼠大體解剖。 稱重并計算臟器指數(shù)的器官。 組織病理學(xué)檢查 所有藥物長期毒性均應(yīng)進(jìn)行給藥部位及給藥部位淋巴結(jié)的病理學(xué)檢查。 對照組、高劑量組及尸檢異常時要詳細(xì)檢查。其它劑量組應(yīng)取材保存，在高劑量組有異常時再進(jìn)行檢查。 一般需進(jìn)行病理組織學(xué)檢查的組織或器官：詳見下表 解剖時肉眼可觀察到的其他異常器官組織應(yīng)做詳細(xì)的病理組織學(xué)檢查。 應(yīng)根據(jù)中藥的性、味、功效、主治等情況增加相應(yīng)的組織病理學(xué)檢查。 組織的病理學(xué)檢查應(yīng)根據(jù)藥物的特點(diǎn)及國家規(guī)定的技術(shù)要求進(jìn)行。,三、中藥新藥免疫毒性研

21、究技術(shù)要點(diǎn),免疫毒性指外源性化合物對機(jī)體免疫系統(tǒng)的損傷作用，包括兩類： 免疫抑制 免疫增強(qiáng),型過敏反應(yīng)試驗 主動皮膚過敏試驗（ACA） 主動全身過敏試驗（ASA） 被動皮膚過敏試驗（PCA） 試驗一 主動皮膚過敏試驗 （Active Cutaneous Anaphylaxis, ACA ） 動物： 豚鼠 陽性藥： 2，4-二硝基氯代苯 （1%的致敏濃度和0.1%的激發(fā)濃度）,試驗方法： 致敏：在第0、第7和第14天，以致敏劑量皮膚局部給藥（致敏接觸階段應(yīng)保證受試物在皮膚上的停留時間(6小時)） 激發(fā)：末次給受試物致敏后14天，再次將受試物涂于脫毛區(qū)激發(fā)，6小時左右后，觀察72小時內(nèi)皮膚過敏反應(yīng)

22、情況，記錄各組各時間的平均分值，并按皮膚過敏反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，同時應(yīng)密切觀察動物是否有哮喘、站立不穩(wěn)或休克等嚴(yán)重的全身性過敏反應(yīng)出現(xiàn)。 根據(jù)試驗組和對照組動物皮膚反應(yīng)的差別，判斷受試物對皮膚過敏反應(yīng)的性質(zhì)，計算致敏發(fā)生率（將出現(xiàn)皮膚紅斑、水腫或全身過敏反應(yīng)的動物例數(shù)除以受試動物總數(shù)）。,試驗二 主動全身過敏試驗 （Active Systemic Anaphylaxis, ASA） 動 物： 豚鼠 陽性對照組： 15mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì) 試 驗方 法： 每組動物數(shù)至少6只。 低劑量組： 臨床最大劑量 高劑量組：低劑量的數(shù)倍量。 致敏：靜脈、腹腔或皮下注射，隔日一次

23、，共3-5次 激發(fā)：末次致敏后第1014日一次快速靜脈內(nèi)給藥。 劑量為致敏劑量的25倍，給藥容積12ml 觀察每只動物的癥狀及體重；計算過敏反應(yīng)發(fā)生率。,試驗三 被動皮膚過敏試驗 （Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA） 動物：大鼠，小鼠，有時用豚鼠 陽性對照：1-5mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì) 試驗方法： 每組動物數(shù)至少6只。 制備抗血清： 低劑量組：臨床最大劑量 高劑量組：低劑量的數(shù)倍量。 致敏：靜脈、腹腔或皮下注射，隔日一次，共35次 激發(fā)：末次致敏后1014天左右采血，制備抗血清,放 樣： 將上述各組抗血清用生理鹽水稀釋成1：2、1：

24、8、1：32或合適的稀釋度。 在動物背部預(yù)先脫毛34cm2的皮內(nèi)注射各對應(yīng)組的抗血清0.1mL。 經(jīng)24或48小時后，各組靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量的0.51%伊文思蘭染料共1mL。 激發(fā)注射30分鐘后麻醉處死各組動物，剪取背部皮膚，進(jìn)行藍(lán)斑的測定?？刹捎弥苯訙y定法或比色測定法。,四、中藥新藥刺激性和溶血性研究技術(shù)要點(diǎn),刺激性是指中藥、天然藥物制劑（包括活性成分和賦形劑）經(jīng)皮膚、粘膜、腔道、肌肉、血管等非口服途徑給藥，經(jīng)局部吸收或注射后對給藥部位以及全身產(chǎn)生的毒性作用，包括血管、肌肉、粘膜等刺激性。 溶血性是指中藥、天然藥物制劑（包括活性成分和賦形劑）產(chǎn)生的溶血或紅細(xì)胞凝聚等反應(yīng)。

25、,(一)刺激性試驗方法 1、血管刺激性試驗 試驗動物：家兔，動物數(shù)每組不少于3只。 生理鹽水或溶媒對照 可采用同體左右側(cè)自身對比法 給藥部位：選用耳緣靜脈。多次給藥一般不超過7天。 單次給藥刺激性試驗：給藥后4896小時對動物和注射部位進(jìn)行肉眼觀察； 多次給藥刺激性試驗：每天給藥前以及最后一次給藥后4896小時對動物和注射部位進(jìn)行肉眼觀察。 給藥部位組織病理學(xué)檢查,2、肌肉刺激性試驗 試驗動物：家兔，也可選用大鼠 生理鹽水或溶媒作為陰性對照 分別在左右兩側(cè)股四頭肌內(nèi)以無菌操作法各注入一定量的受試物，觀察給藥后不同時間注射局部肌肉反應(yīng)情況，如充血、紅腫、變性、壞死等。 注射后48小時處死動物，解剖取出股四頭肌，縱向切開，觀察注射部位肌肉的刺激反應(yīng)，并計算相應(yīng)的反應(yīng)級，并進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查，提供病理照片。,3、皮膚刺激性試驗 試驗動物：家兔，每組動物數(shù)48只，雌、雄各半，也可選用小型豬或其他種屬的動物。 設(shè)賦形劑或溶媒對照，采用同體左右側(cè)自身對比法。 將受試物0.5 ml直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布（2.5 cm2.5 cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定；另一側(cè)涂布賦形劑或溶媒做對照。貼敷