1、第八章 基因工程寄生蟲疫苗 Parasite Vaccine By Gene Engineering 第一節(jié) 概 述 （Section I Outline） 人體寄生蟲與人類共存的歷史可追溯到遠(yuǎn)古，在漫長(zhǎng)的歲月里寄生蟲和宿主的關(guān)系經(jīng)歷了“史前期”，“形成期”和“確定期”。 據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前大約1/4世界人口受到五大寄生蟲感染（瘧疾、血吸蟲、利什曼原蟲、絲蟲、錐蟲）要全面控制寄生蟲病的流行，所面臨的仍是一條漫長(zhǎng)而艱辛之路。,寄生蟲與宿主的關(guān)系保持平衡是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中逐步形成的。 經(jīng)過(guò)自然選擇宿主逐漸形成有效的免疫反應(yīng)以防范寄生蟲的毒害作用。 通過(guò)高度自然選擇，一些種群的寄生蟲和宿主關(guān)系不相適

2、應(yīng)，難以平衡逐步消失。而另一些種群在進(jìn)化過(guò)程中獲得某些保護(hù)自己而不被宿主清除的功能，即所謂寄生蟲的免疫逃避機(jī)制。,一、對(duì)寄生蟲疫苗研究成功的關(guān)鍵（key of success ） 1、包括選擇免疫應(yīng)答難以作用的寄生部位； 2、寄生蟲在宿主體內(nèi)不同發(fā)育階段表現(xiàn)抗原特異性改變，從而使獲得性免疫力有嚴(yán)格的階段（或期）特異性。各階段（期）因其不同的表面抗原而避開了前一階段引起的宿主免疫效應(yīng)機(jī)制的傷害。寄生蟲表面抗原變異在錐蟲，瘧原蟲，巴貝蟲等致病性原蟲表現(xiàn)更為明顯。,3、寄生蟲在抗原變異，抗原摹擬和寄生蟲攝入宿主DNA和獲得宿主蛋白或以宿主抗原偽裝自己方面也表現(xiàn)出非常復(fù)雜而有效的免疫逃避機(jī)制。但是，任

3、何一種寄生蟲在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活的免疫逃避機(jī)制均未能完全搞清楚。仍是一個(gè)值得深入研究和探討的課題。,二、寄生蟲疫苗的分類（category of parasite vaccine） 寄生蟲疫苗研究始于1903年，至今洽好100年?？煞诸悶椋?帶低毒活野生型疫苗（自然界中分離的）； 致弱病原疫苗（減毒活疫苗）； 滅活或死病原疫苗； 亞單位疫苗（包括抽提物或代謝產(chǎn)物）； 合成的或重組的抗原疫苗； 抗獨(dú)特型Ab疫苗； DNA疫苗。,三、問(wèn)題（questions） 迄今仍無(wú)公認(rèn)的寄生蟲病疫苗，究其原因： （1）多數(shù)寄生蟲為多細(xì)胞生物，寄生蟲抗原成分非常復(fù)雜，很難找準(zhǔn)特定保護(hù)性抗原，保護(hù)性免疫應(yīng)答機(jī)制不清

4、。 （2）寄生蟲抗原免疫所誘導(dǎo)的大都為部分保護(hù)性免疫力（一般為30%70%）。 （3）寄生蟲形成種種逃避宿主免疫應(yīng)答的辦法，其機(jī)制尚待闡明。 （4）寄生蟲一般引起慢性長(zhǎng)期感染，病期因寄生蟲生活史中形態(tài)上不同，常存在數(shù)階段（期）。,第二節(jié) 基因工程寄生蟲疫苗的研究現(xiàn)狀 （Research status of parasite vaccine by gene engineering） 一、瘧疾疫苗(maria vaccine) 世界上每年3-5億人口感染人瘧，1.5-3百萬(wàn)人死于瘧疾。大多數(shù)嚴(yán)重發(fā)病和死亡發(fā)生在兒童和孕婦，主要是惡性瘧（由惡性瘧原蟲感染引起）。,(一)瘧疾及瘧原蟲,瘧疾（Malar

5、ia），又名打擺子，經(jīng)按蚊叮咬而感染瘧原蟲所引起的蟲媒傳染病。,9,全球瘧疾疫情分布圖,全球人口的35%(約23.7億人)存在患瘧疾的風(fēng)險(xiǎn)。而這一數(shù)據(jù)比起以往有所下降。研究人員還指出，目前全球有大約10億人口居住在瘧疾高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)，而非洲以外的感染率低于5%，撒哈拉以南的非洲地區(qū)是目前瘧疾感染最嚴(yán)重的地方。,10,瘧疾的危害,瘧疾仍然是當(dāng)今人類的最大殺手之一， 每年瘧疾發(fā)病人數(shù)為35億，因惡性瘧引起死亡超過(guò)100萬(wàn)。,11,瘧疾的主要癥狀,周期性寒戰(zhàn) 發(fā)熱 頭痛 出汗 貧血 脾腫大,12,間日瘧原蟲生活史與形態(tài),人（脊椎動(dòng)物宿主）,蚊（媒介宿主）,肝細(xì)胞 內(nèi)發(fā)育,紅細(xì)胞 內(nèi)發(fā)育,胃內(nèi)配 子生殖,

6、胃壁孢 子生殖,間日瘧原蟲生活史與形態(tài),人體內(nèi)發(fā)育階段 紅細(xì)胞外期（肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)育）,TS 子孢子 （蚊） BS,紅外期裂殖體,休眠子,紅外期裂殖子,子孢子 紅外期裂殖體 裂殖子 （蚊） （肝細(xì)胞）,間日瘧原蟲生活史與形態(tài),人體內(nèi)發(fā)育階段 紅細(xì)胞內(nèi)期（紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育）,紅外期裂殖子侵入紅細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性的裂體增殖循環(huán)和有性體形成 環(huán)狀體 (ring form) 大滋養(yǎng)體 (trophozoite) 裂殖體 (schizont) 紅內(nèi)期裂殖子 (merozoite) 配子體(雌、雄) (gametocyte),間日瘧原蟲生活史與形態(tài),蚊體內(nèi)發(fā)育階段 配子生殖(胃腔內(nèi)) 孢子生殖(胃壁上),雄配子體,雌配

7、子體,雄配子,雌配子,合子,合子,動(dòng)合子,囊合子(卵囊),子孢子,子孢子 (唾腺),瘧原蟲的生活史 （圖）,雌雄配子體,雌雄配子,動(dòng)合子 合子,囊合子,子孢子母細(xì)胞,感染性子孢子,蚊體內(nèi),人體內(nèi),遲發(fā)性,速發(fā)性,復(fù)發(fā),急性發(fā)作,預(yù) 防,2005年6月30日，美國(guó)總統(tǒng)布什說(shuō)：“瘧疾（malaria）問(wèn)題是非常悲劇性的，因?yàn)樵摷膊”旧硎歉叨瓤芍巍⒖煞赖摹?蓋茨向瘧疾開戰(zhàn),控制傳染源 切斷傳染途徑 保護(hù)易感人群,1億美元 研制幾種抗瘧疾新藥 5070萬(wàn)美元 對(duì)殺蟲劑和滅殺蚊子的手段進(jìn)行改進(jìn) 1.076億美元：葛蘭素史克公司，用于研制一種抗瘧疾疫苗，最早2010年上市,蓋茨基金會(huì)2006年12月12日

8、宣布，將再提供8350萬(wàn)美元用于瘧疾的防治。 世界銀行發(fā)起一項(xiàng)全球抗擊瘧疾計(jì)劃，準(zhǔn)備動(dòng)用5億至10億美元資金幫助非洲國(guó)家抗擊瘧疾。,（二）瘧疾疫苗的分類,1.抗紅前期原蟲疫苗 紅前期瘧疾疫苗又稱抗感染疫苗，主要針對(duì)瘧原蟲子孢子或肝內(nèi)期瘧原蟲，紅前期疫苗通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，來(lái)阻止子孢子入侵肝細(xì)胞或誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性識(shí)別感染肝細(xì)胞的 T細(xì)胞，來(lái)殺死感染肝細(xì)胞或干擾瘧原蟲在肝細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育增殖，阻止其釋放出感染性裂殖子，從而達(dá)到抗感染的效果?？辜t前期原蟲疫苗達(dá)到100%的保護(hù)率才能真正達(dá)到保護(hù)效果, 因?yàn)橹灰袉蝹€(gè)子孢子逃逸就可能引起機(jī)體的感染。,位于子孢子表面的環(huán)子孢子蛋白(circumsp

9、orozoite protein，CSP) 和血凝素相關(guān)匿名蛋白(thrombospondin related anonymous protein，TRAP) 是針對(duì)該期原蟲的2個(gè)重要的疫苗候選抗原。目前研究較為深入的紅前期疫苗是GSK（GlaxoSmithKline，GSK）生物公司和美國(guó)陸軍醫(yī)學(xué)研究院合作開發(fā)的RTS,S ASO1/AS02疫苗。RTS，S疫苗是全球第一種早期療效顯著 ，它由 2 部分組成 ,即 CSP的 19 個(gè) NANP重復(fù)序列及其 C未端序列與乙肝表面抗原融合而成,2 抗紅內(nèi)期原蟲疫苗 紅內(nèi)期瘧疾疫苗又稱抗病疫苗，其機(jī)制一般是阻斷裂殖體入侵紅細(xì)胞或避免感染紅細(xì)胞黏附于

10、血管內(nèi)皮細(xì)胞。裂殖子表面蛋白和頂端復(fù)合體抗原成為疫苗研究的焦點(diǎn)，多種抗原被作為候選疫苗進(jìn)行研究。目前有些疫苗已進(jìn)人臨床試驗(yàn)并取得階段性成果，單一抗原疫苗MSP-1、AMAl、GLURP、SERA、ISA720及多抗原疫苗GMZ2、PfCP-2.9/ISA720,3 傳播阻斷性疫苗 通過(guò)阻止瘧原蟲在蚊蟲體內(nèi)的有性增殖而達(dá)到阻斷瘧疾傳播的目的，在這個(gè)過(guò)程中，雖然不能使個(gè)體免于瘧疾感染，也不能減輕癥狀，但能阻斷蚊蟲將瘧原蟲從一個(gè)宿主傳播至另一個(gè)宿主 ，傳播阻斷性疫苗候選抗原主要表達(dá)于蚊蟲階段瘧原蟲表面 ，是當(dāng)前瘧疾疫苗研究的熱點(diǎn)。雌雄配子、合子和動(dòng)合子所表達(dá)的表面蛋白是研制傳播阻斷性疫苗的重要靶抗原

11、。,（三）瘧疾疫苗研制的3個(gè)階段,1.第一階段是減毒疫苗 2.第二階段是亞單位疫苗 3.第三階段是基因疫苗,（四）瘧疾基因疫苗,1.孢子體表面蛋白2基因疫苗 ssP2 2.環(huán)子孢子蛋白基因疫苗 CSP（體液免疫） 3.瘧原蟲蛋白17基因疫苗 HEP17(肝細(xì)胞空泡膜，紅細(xì)胞膜)（CTL反應(yīng)） 4.HEP17/CSP聯(lián)合基因疫苗,5.裂殖子主要表面蛋白基因疫苗 AWA1、 AWA2、Pf55/RESA MSP1 6.有性期抗原基因疫苗 Pfs230、 48/45、27、25、28,瘧疾疫苗研制所面臨的困難和挑戰(zhàn),(1) 缺乏保護(hù)作用強(qiáng)的候選抗原。盡管在過(guò)去25年中已鑒定了約40 個(gè)疫苗候選抗原,

12、 但能產(chǎn)生強(qiáng)而持久保護(hù)性免疫力的抗原仍十分有限; (2)缺乏對(duì)瘧疾保護(hù)性免疫機(jī)制的了解, 瘧原蟲生活史復(fù)雜、抗原具有期特異性并存在高度變異、瘧原蟲具有多種入侵途徑和逃避宿主免疫攻擊的機(jī)制; (3) 缺乏有效的動(dòng)物模型。由于瘧原蟲抗原序列存在種間差異, 因此無(wú)法用動(dòng)物瘧原蟲模型來(lái)評(píng)價(jià)人體瘧疾疫苗; (4) 缺乏持久的免疫力和難以產(chǎn)生足夠高水平的抗體。,綠水青山枉自多 華佗無(wú)奈小蟲何 千村薜荔人遺矢 萬(wàn)戶蕭疏鬼唱歌,送瘟神 毛澤東,（一）血吸蟲病裂體吸蟲,血吸蟲由于寄生在人體的血管內(nèi)而得名；它引起的血吸蟲病俗稱大肚子??；,血吸蟲對(duì)人類的危害 1.分布廣 2.后果嚴(yán)重,二、血吸蟲疫苗,全球血吸蟲分布

13、圖,分布,后果嚴(yán)重,寄生于人體的血吸蟲（6種） 埃及血吸蟲 （Schistosoma haematobium） 1851 曼氏血吸蟲 （Schistosoma mansoni） 1902 日本血吸蟲 （Schistosoma japonicum） 1903 間插血吸蟲 （Schistosoma intercalatum） 1934 湄公血吸蟲 （Schistosoma mekongi） 1978 馬來(lái)血吸蟲 （Schistosoma malayensis） 1988,日本血吸蟲 Schistosoma japonicum, S.j,成蟲主要寄生于腸系膜下靜脈，致病以蟲卵為主，可引起嚴(yán)重的血吸蟲

14、病。,血吸蟲的主要特點(diǎn),成蟲似線蟲，圓柱形；雌雄異體，但常合抱 成蟲在血管內(nèi)（門脈系統(tǒng)）寄生，蟲卵從糞或尿中排出 生活史中無(wú)雷蚴和囊蚴階段 尾蚴為感染期，經(jīng)皮膚感染 僅有一個(gè)中間宿主：釘螺 蟲卵無(wú)蓋，蟲卵是主要致病因素，危害嚴(yán)重,日本血吸蟲生活史簡(jiǎn)圖,人體內(nèi)階段,人體外階段,日本血吸蟲生活史宿主,中間宿主,釘螺是血吸蟲的唯一中間宿主。,日本血吸蟲生活史宿主,中間宿主,保蟲宿主,牛、羊、豬、狗、鼠等30多種哺乳動(dòng)物。,終宿主,水牛,1.感染條件：,接觸“疫水”,日本血吸蟲生活史尾蚴感染,2.感染方式：,尾蚴主動(dòng)鉆入皮膚,尾蚴性皮炎,日本血吸蟲生活史尾蚴感染,1.感染條件：,日本血吸蟲致病性,尾蚴

15、 童蟲 成蟲 蟲卵,致病機(jī)理*,（分泌物） 尾蚴性皮炎,（機(jī)械性損傷） 肺炎,（奪取營(yíng)養(yǎng)） 營(yíng)養(yǎng)不良 （機(jī)械性刺激） 血管內(nèi)膜炎,（蟲卵肉芽腫） 肝、腸纖維化,CAg,（形成CIC） 血吸蟲病腎病、關(guān)節(jié)炎,*,肝.腸纖維化,日本血吸蟲致病性,蟲卵結(jié)節(jié)阻塞竇前靜脈,回心血流受阻,門脈高壓,腹水,大肚子病,1.蟲源性疫苗 死疫苗/減毒活疫苗 2.基因工程疫苗 3.DNA疫苗 4.合成多肽抗原疫苗 5.抗獨(dú)特型抗體疫苗 Ab1 Ab2 抗Ab2 cocktail,（二）.血吸蟲疫苗分類,WHO/TDR選擇的6種血吸蟲病侯選疫苗抗原： 谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶 （GST） 副肌球蛋白 （Sm97） 照射減毒抗

16、原5 （IrV-5） 磷酸丙糖異構(gòu)酶 （TPI） 完整表膜蛋白 （Sm23） 脂肪酸結(jié)合蛋白 （Sm14）,（三）.血吸蟲基因疫苗,（四）存在的問(wèn)題,1.血吸蟲存在免疫逃避機(jī)制 2.在動(dòng)物模型和人體內(nèi)的免疫機(jī)制差異 3.免疫效應(yīng)機(jī)制的選擇誘導(dǎo) 4.抗原表位的鑒定 5.糖基表位 6.保護(hù)水平 7.超敏反應(yīng) 8.佐劑, 抗原偽裝 抗體封閉 分泌CAg 免疫耐受,第三節(jié) 基因工程寄生蟲疫苗研制 的前景及展望 （foreground and prospect） 特定寄生蟲疫苗的成功研制依賴于對(duì)寄生蟲感染時(shí)所引起免疫應(yīng)答的細(xì)胞和體液成分清楚的了解，以及對(duì)能誘導(dǎo)保護(hù)性應(yīng)答抗原的確定。 最近在驗(yàn)證和生產(chǎn)某些

17、寄生蟲病疫苗潛在保護(hù)性抗原方面取得明顯進(jìn)展，但對(duì)免疫宿主所誘導(dǎo)保護(hù)性免疫力的機(jī)制了解以及人對(duì)寄生蟲病免疫應(yīng)答特征的研究進(jìn)展不大。,1998年WHO/TDR與美國(guó)NIH/USAID密切協(xié)作資助血吸蟲疫苗研制計(jì)劃（SVDP）主要是促進(jìn)對(duì)兩個(gè)重組曼氏血吸蟲抗原副肌球蛋白和MAP4/TPI的I期臨床試驗(yàn)以及另兩個(gè)候選抗原IrV-5和MAP-3（Sm23）的DNA疫苗實(shí)驗(yàn)研究，以期找到安全有效的血吸蟲疫苗。SVDP將血吸蟲疫苗候選抗原研究集中在重組抗原和DNA疫苗的評(píng)價(jià)上。,從全球看，對(duì)寄生蟲疫苗新候選抗原的發(fā)現(xiàn)，研制和臨床試驗(yàn)需要各國(guó)共同協(xié)作，特別是發(fā)達(dá)國(guó)家科學(xué)家和寄生蟲病流行國(guó)家的科研機(jī)構(gòu)間的協(xié)作。,對(duì)瘧疾，利什曼病和血吸蟲病，一種重組抗原的混合疫苗可能克服遺傳局限性和