1、上節(jié)課我們學(xué)了什么？,問題,生物反應(yīng)器,生物反應(yīng)器的一些概念 生物反應(yīng)器的基本類型,第二章 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應(yīng)器,學(xué)時：2節(jié)課 主要內(nèi)容： 常用培養(yǎng)方法 動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式 細(xì)胞培養(yǎng)過程的放大 動物細(xì)胞培養(yǎng)生物放大器,動物細(xì)胞培養(yǎng)開始于上世紀(jì)初1962年, 其規(guī)模逐漸擴(kuò)大, 發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法(生產(chǎn)酶、生長因子、疫苗和單抗等)。,相關(guān)知識介紹,利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術(shù)產(chǎn)品市場份額的50% 。,發(fā)展：在過去幾十年來，從使用轉(zhuǎn)瓶(roller bottle) 、CellCube等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應(yīng)器（Bio

2、reactor）進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。,一是在工藝生產(chǎn)時不能大規(guī)模制備產(chǎn)品； 二是非批量生產(chǎn)容易導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的不均一性 三是難以對同批生產(chǎn)進(jìn)行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。,第一代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)核心問題：難以產(chǎn)業(yè)化！,隨著生物技術(shù)的發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，以便獲得大量有用的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。 采用玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)方法，已不能滿足所需細(xì)胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。 自70年代以來，較常見的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器有空氣提升反應(yīng)器，中空纖維管反應(yīng)器，無泡攪拌反應(yīng)器及籃式生物反應(yīng)器等。 80年代以來，人們逐漸開始以生物反應(yīng)器培養(yǎng)代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。,動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)： （large-scale cul

3、ture technology） 定義：指在人工條件下（設(shè)定pH、溫度、溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。,通過大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)哺乳類動物細(xì)胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法,雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞 人二倍體細(xì)胞 cho（中華倉鼠卵巢）細(xì)胞 BHK-21(倉鼠腎細(xì)胞) Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，是貼壁依賴的成纖維細(xì)胞)等。,可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細(xì)胞,個性化培養(yǎng)基是胞細(xì)培養(yǎng)基的發(fā)展方向,圖 8.1 細(xì)胞培養(yǎng)瓶,圖 8.3 細(xì)胞工廠,Spinner培養(yǎng)系統(tǒng),口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病

4、毒疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗、及干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子和、促紅細(xì)胞素、松弛素、生長激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。,目前已實現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品：,6.原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡,第一節(jié) 常用的培養(yǎng)方法,動物細(xì)胞生長特性：,1.細(xì)胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素,2.細(xì)胞大，無細(xì)胞壁，機(jī)械強度低，環(huán)境適應(yīng)性差,3.需氧少，不耐受強力通風(fēng)與攪拌,4.群體生長效應(yīng)，貼壁生長（錨地依賴性）,5.培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高,非貼壁依賴型細(xì)胞：無需附著于固相表面即可生長，包括血液、淋巴組織細(xì)胞、許多腫瘤細(xì)胞及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。,依據(jù)在體外培養(yǎng)時對生

5、長基質(zhì)依賴性差異，動物細(xì)胞可分為兩類：,貼壁依賴型細(xì)胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長，大多數(shù)動物細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞均屬于這一類。,“貼壁單核”細(xì)胞培養(yǎng),貼壁的單核細(xì)胞,貼壁細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)的人參愈傷組織,知識回顧,一般步驟：,無菌取出目的細(xì)胞所在組織，用培養(yǎng)液漂洗干凈,以鋒利無菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊,將小組織塊置解離液（含蛋白酶類）離散細(xì)胞。,低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng),動物細(xì)胞培養(yǎng)步驟,植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)流程,懸浮細(xì)胞培養(yǎng),提取純化 產(chǎn)物,脫分化：離體植物器官、組織或細(xì)胞，在培養(yǎng)了一段時間后，會通過細(xì)胞分裂，形成愈傷組織（細(xì)

6、胞排列疏松而無規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞）。,收集細(xì)胞,藥物制劑,通過植物組織培養(yǎng)的藥物：奎寧、長春堿、洋地黃、紫草素、人參皂甙等,大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝流程圖,細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器,提取,細(xì)胞,誘生劑,細(xì)胞,產(chǎn)品（腫瘤抗原）,純化,產(chǎn)品（干擾素）,純化,提取,產(chǎn)品（單克隆抗體）,濃縮純化,7,9,8,6,5,4,3,2,1,10,大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法： 貼壁培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng) 固定化培養(yǎng),一、貼壁培養(yǎng)（attachment culture）,細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。 1、生長特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲

7、分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。,貼壁培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī),2、貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點： 容易更換培養(yǎng)液：細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。 容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。 當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。 同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。 適用于所有類型細(xì)胞。,灌注培養(yǎng),3、貼壁培養(yǎng)的缺點： 與懸浮培養(yǎng)法相比， 擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大； 占地面積大； 不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長；,4、細(xì)胞貼壁的表面： 要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具

8、一定電荷密度；若為有機(jī)物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。,5、貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)： 主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維（后面專題介紹）、玻璃珠、微載體系統(tǒng)（后面介紹）等。,貼壁培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī),細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器,轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)： 為最初采用系統(tǒng)，一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條途徑。細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。,轉(zhuǎn)瓶機(jī),轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的優(yōu)、缺點,勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小，細(xì)胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制。,優(yōu)點：,結(jié)構(gòu)簡單，投資少，技術(shù)成熟，重復(fù)性

9、好，放大只需簡單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等。,缺點：,二、懸浮培養(yǎng)（suspension culture） 指細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等，是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。,小規(guī)模懸浮培養(yǎng),懸浮培養(yǎng)瓶,用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的新方向。,無血清懸浮培養(yǎng),三、固定化培養(yǎng)（immobilization culture）：,將動物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來，再進(jìn)行培養(yǎng)。上述兩大類細(xì)胞都適用，具有細(xì)胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強等優(yōu)點，細(xì)胞易與產(chǎn)物分開

10、，有利于產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯(lián)法、包埋法、微囊法等。,1、吸附法: 用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法稱為吸附法（adhesion）。操作簡便、條件溫和、是動物細(xì)胞固定化中最早研究使用的方法。 缺點：載體的負(fù)荷能力低，細(xì)胞易脫落。微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法的代表，稍后專門介紹。,2、共價貼附法: 利用共價鍵將動物細(xì)胞與固相載體結(jié)合的固定化方法稱為共價貼附法（attachment by covalent bonding）。此法可減少細(xì)胞的泄漏，但須引入化學(xué)試劑，對細(xì)胞活性有影響，且因貼附而導(dǎo)致擴(kuò)散限制小，細(xì)胞得不到保護(hù)。,3、離子

11、/共價交聯(lián)法: 雙功能試劑處理細(xì)胞懸浮液，會在細(xì)胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交聯(lián)作用，此固定化細(xì)胞方法稱為離子/共價交聯(lián)法（cross-linking by covalent bonding）。交聯(lián)試劑會使一些細(xì)胞死亡，也會產(chǎn)生擴(kuò)散限制。,4、包埋法: 將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法稱為包埋法（entrapment）。 優(yōu)點：步驟簡便、條件溫和、負(fù)荷量大、細(xì)胞泄漏少，抗機(jī)械剪切。 缺點：擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴型細(xì)胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。,石蠟切片中底部薄層軟蠟包埋

12、法,甲基丙烯酸甲酯包埋標(biāo)本,微囊型包埋法,5、微囊法（microencapsulation）: 用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-400m為宜。,第二節(jié) 大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式,深層培養(yǎng)可分為: 分批式 流加式 半連續(xù)式 連續(xù)式 連續(xù)式 灌注式,一、分批式培養(yǎng)（batch culture） 較早期的方式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng) 一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基。,特點:,操作簡單，

13、培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險小,直觀反映細(xì)胞生長代謝的過程。,可直接放大。,細(xì)胞的生長分：延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期五個階段。 分批培養(yǎng)的周期多在3-5天，細(xì)胞生長動力學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞先經(jīng)歷對數(shù)生長期（48-72h）細(xì)胞密度達(dá)到最高值后，由于營養(yǎng)物質(zhì)耗竭或代謝毒副產(chǎn)物的累積細(xì)胞生長進(jìn)入衰退期進(jìn)而死亡，表現(xiàn)出典型的生長周期。收獲產(chǎn)物通常是在細(xì)胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。,二、流加式培養(yǎng)（feeding culture）,細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/21/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰亡期或衰亡期后進(jìn)行

14、終止回收整個反應(yīng)體系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋白。,1、流加培養(yǎng)物的方式 流加的時間通常在指數(shù)生長后期，細(xì)胞進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)?？梢蕴砑右淮危部商砑佣啻?，凡是促細(xì)胞生長的物質(zhì)均可以進(jìn)行添加。流加的總體原則是維持細(xì)胞生長相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營養(yǎng)成分既不過剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營養(yǎng)利用效率下降而成為無效的利用；也不缺乏導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制或死亡。,2、流加工藝中的營養(yǎng)成分（三大類）：,葡萄糖：供能物質(zhì)、碳源物質(zhì)，濃度較高則產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要控制濃度，以足夠維持細(xì)胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。 谷氨酰胺：供能物質(zhì)、氮源物質(zhì)，需要控制濃度。

15、大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡，谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因。 氨基酸、維生素及其他：必需氨基酸、非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成分如膽堿、生長刺激因子。,三、半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture）,1、又稱重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。,2、半連續(xù)式特點： 培養(yǎng)物的體積逐步增加； 可進(jìn)行多次收獲； 細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可

16、延續(xù)到很長時間。,優(yōu)點：操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長時期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。,四、連續(xù)式培養(yǎng)（continuous culture）,1、常見的懸浮培養(yǎng)模式：采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。在細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基（防止衰退期出現(xiàn)）；同時，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。,2、連續(xù)式培養(yǎng)的特點： 細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長； 產(chǎn)物體積不斷增長； 可控制衰退期與下降期。,連續(xù)式培養(yǎng),3、優(yōu)點： 培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細(xì)胞在穩(wěn)

17、定狀態(tài)下生長。 穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。 在穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞所處的環(huán)境條件可維持不變（如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長速率）。 細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，特別是生物反應(yīng)器的主要營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。,4、不足： 由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染； 在長周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長特性以及分泌產(chǎn)物容易變異； 對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。,五、灌流式培養(yǎng)（perfusion culture）,1、把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和

18、產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。,它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時同時也取出了部分細(xì)胞。,一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，這種反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。,如：中空纖維生物反應(yīng)器,灌流式培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要有兩種形式：,中空纖維半透膜可透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細(xì)胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛用于產(chǎn)物分泌性動物細(xì)胞的

19、生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。,中空纖維反應(yīng)器示意圖,細(xì)胞,培養(yǎng)基出口,空氣與CO2出口,空氣與 CO2入口,培養(yǎng)基入口,固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長。流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。,另一種形式是固定床或流化床生物反應(yīng)器,軸向絕熱式 徑向絕熱式 列管式,固定床反應(yīng)器：氣體流經(jīng)固定不動的催化劑床層進(jìn)行催化反應(yīng)的裝置,流化床反應(yīng)器

20、： 固體顆粒被流體吹起呈懸浮狀態(tài)，可作上下左右劇烈運動和翻動，好象是液體沸騰一樣，故流化床反應(yīng)器又稱沸騰床反應(yīng)器。,1旋風(fēng)分離器 2筒體擴(kuò)大段 3催化劑入口 4筒體 5冷卻介質(zhì)出口 6換熱器 7冷卻介質(zhì)進(jìn)口 8氣體分布板 9催化劑出口 10反應(yīng)氣入口,2、灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點： 細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量； 連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低； 反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高； 產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的

21、活性。,六、細(xì)胞工廠培養(yǎng),聚苯乙烯材料，無菌，長度335mm，寬度205mm,這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級聚苯乙烯制成，使用后可隨意處理。其最大缺點是：經(jīng)胰酶消化后，很難將細(xì)胞完全洗出。,第四節(jié) 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡介,動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能否大規(guī)模工業(yè)化、商業(yè)化，關(guān)鍵在于能否設(shè)計出合適的生物反應(yīng)器。首先必須滿足在低剪切力及良好的混合狀態(tài)下，能夠提供充足的氧以供細(xì)胞生長及細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)物的合成。,細(xì)胞培養(yǎng)罐,一、生物反應(yīng)器分類,1.懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器；,2.貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器（微

22、載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器；,3.包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器：如流化床反應(yīng)器、固化床反應(yīng)器。,按其培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，可分三類：,二、攪拌罐生長反應(yīng)器,最經(jīng)典、最早被采用。針對動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點，采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪拌器的作用使細(xì)胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，使養(yǎng)分充分被細(xì)胞利用，并增大氣液接觸面，有利于氧的傳遞。,三、氣升式生物反應(yīng)器,1979年首次成功應(yīng)用氣升式生物反應(yīng)器進(jìn)行了動物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。氣升式生物反應(yīng)器的優(yōu)點： 罐內(nèi)液體流動溫和均勻，產(chǎn)生剪切力小，對細(xì)胞損傷較??； 可直接噴射空氣供氧，因而氧傳遞率較高； 液體循環(huán)量大，細(xì)胞和養(yǎng)分都能均

23、勻分布于培養(yǎng)液中； 結(jié)構(gòu)簡單，利于密封并降低了造價。,四、鼓泡式生物反應(yīng)器,與氣升式反應(yīng)器相類似，是利用氣體鼓泡來進(jìn)行供氧及混合，其設(shè)計原理與氣升式生物反應(yīng)器也相同。,五、中空纖維生物反應(yīng)器,用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。,優(yōu)點： 占地空間少； 細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109數(shù)量級； 生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時間長，適用于長期分泌的細(xì)胞。,板框式中空纖維反應(yīng)器,液營養(yǎng) 中空纖維板,注意幾個問題：,(一)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 (1)氨離子：細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細(xì)胞密度的主要限制因素。 (2)乳酸：高乳酸濃度必將抑制細(xì)胞生長 (3)二氧化碳：二氧化碳積聚，對細(xì)胞

24、產(chǎn)生毒性作用或者改變細(xì)胞代謝水平。 (4)甲基乙二醛(Mc)：對細(xì)胞有潛在的損傷作用 (5)滲透壓：恒定、適宜 (6)載體：可考慮采用多孔徑載體替代容易使細(xì)胞受機(jī)械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。,(二)細(xì)胞死亡與凋亡,大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是個富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細(xì)胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認(rèn)識到至少是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中死亡主要原因是細(xì)胞凋亡。 用基因工程方法將bcl2基因這種細(xì)胞凋亡抑制基因?qū)爰?xì)胞，bcl2基因的過量表達(dá)能抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。 大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，可通過“細(xì)胞靜止”過程來降低營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生。,(三

25、) 培養(yǎng)基與細(xì)胞系,動物細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以生長、增殖的重要因素。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基開發(fā)成為當(dāng)今細(xì)胞領(lǐng)域的一大課題。 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免血清的批次、質(zhì)量、成分等對細(xì)胞造成的污染、毒性和不利于產(chǎn)品純化等不良影響。 在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長和表達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。,(四)過程監(jiān)控,測量在線氧吸收速率確定從細(xì)胞生長期生產(chǎn)病毒到病毒感染期和細(xì)胞死亡后終止感染的轉(zhuǎn)換時間； 用在線葡萄糖分析儀的測定調(diào)整灌流速度； 測定氧消耗估計營養(yǎng)供應(yīng)率的代謝負(fù)荷； 測定氧吸收速率估測ATP的

26、形成； 測量在線氧化還原能力作為活細(xì)胞濃度的指標(biāo)等均得以應(yīng)用。,測定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中二氧化碳呼出率計算呼吸商。一般來說，呼吸商應(yīng)接近1.0，這就要求細(xì)胞培養(yǎng)中盡量降低氧消耗和二氧化碳排出。 用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行在線蛋白質(zhì)含量測定。另外，用在線蛋白分解與反相色譜監(jiān)測重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品的一致性。,計數(shù)法(細(xì)胞運輸),當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國內(nèi)進(jìn)行寄贈、交換和購買，也在國際交流，為此需要裝運細(xì)胞的方法。 一種是用液氮或干冰貯存運輸，需要特殊容器，較麻煩，且不適于長時間運行。另一方法為充液法，方便當(dāng)行，是當(dāng)前多采用的方法。 具體方法： 選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，待培養(yǎng)近單層后，去掉培養(yǎng)液充滿新培養(yǎng)液。液量要達(dá)培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞一吸塞，保留微量空氣?？諝饬袅窟^多，運輸時大氣泡來回流動對細(xì)胞有干擾作用。一般經(jīng)45天運輸對細(xì)胞活力無大影響。時間過長,細(xì)胞活力下降。到達(dá)后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細(xì)胞生長所需的液體量。置37攝氏度培養(yǎng)，次日傳代。,十一 動物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例,腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)與建系過程 體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的歷史一定程度上代表了動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的發(fā)展歷史。 1952年，蓋爾(Gey)首先成功地建立世界上第一個細(xì)胞