1、2006年 9月色譜Vo .l 24 N o. 5September 2006Chinese Journal of Chrom atography447 450固相萃取-氣相色譜 /負化學電離-質(zhì)譜法測定酸水解植物蛋白及醬油中的 3-氯-1, 2-丙二醇陳捷, 王志元(廣州出入境檢驗檢疫局食品檢測中心, 廣東廣州 510623)摘要: 建立了酸水解植物蛋白及醬油中 3-氯-1, 2-丙二醇 ( 3-MCPD)的固相萃取-氣相色譜 /質(zhì)譜測定方法。樣品經(jīng) Aoisa-HBL 固相萃取柱萃取, 正己烷-乙酸乙酯凈化提取, 七氟丁酰咪唑衍生, 衍生物經(jīng)氣相色譜 /負化學電離-質(zhì)譜( GC /NC I

2、-M S)選擇離子模式 ( SIM )檢測, 外標法定量。 3-MCPD 的定量檢測限為 015 Lg /kg, 平均回收率為 9212% 9714% , 相對標準偏差為 316% 1019% 。該方法檢測靈敏度高, 定性定量準確。關(guān)鍵詞: 氣相色譜 /質(zhì)譜法; 負化學電離源; 選擇離子掃描; 固相萃取; 3-氯-1, 2-丙二醇; 水解植物蛋白; 醬油中圖分類號: O658文獻標識碼: A文章編號: 1000-8713( 2006)05-0447-04欄目類別: 研究論文D eterm ination of 3-M onochloropropane-1, 2-D iol in Hydroly

3、zedVegetable Proteins and Soy by Solid Phase Extractionand Gas Chrom atography /Negative Chem icalIon ization-M ass Spectrom etryCHEN Jie, W ANG Zhiyuan(F ood In spection Cen ter, Guan gzhou En tr y & Ex it In spection and Qu ar an tin e Bu r eau, Guan g zhou 510623, Ch ina )Abstract: Solid phase ex

4、traction ( SPE) and gas chromatographic/negative chem ical ioniza-tion-m ass spectrom etric ( GC /NCI-M S) method w as deve loped for the determ ination of 3-monochloropropane-1, 2-diol ( 3-MCPD) in hydrolyzed vegetable proteins (HVP ) and soy. T he optim ized conditions for the extraction and clean

5、up of 3-MCPD on an Aoisa-HBL column were investigated. T he extract w ith hexane-ethyl acetate was evaporated to nearly dry by N2 at 40 e and derivatization was performed w ith 1-( heptafluorobutyry l) mi idazole at 70 e for 30 m in. The m ixture w as then injected into a gas chromatograph w ith a D

6、B-5MS capillary column, de-tected by a mass spectrometer in negative chem ical ionization and selected ion monitoring mode (NCI/SIM ) and quantified w ith external standard calibration. The lim it of quantitation (LOQ ) for 3-MCPD w as 0. 5 Lg /kg. The average recovery was in a range of 92. 2% - 97.

7、 4% w ith a re-l ative standard dev iation range of 3. 6% - 10. 9%. The results indicated that the method could be used for the sensitive and accurate determ ination of 3-MCPD in foods and agriculture products. K ey words: gas chromatography /m ass spectrometry ( GC /MS); negative chem ical ionizati

8、on(NCI); selected ion monitoring ( SIM ); solid phase extraction ( SPE); 3-mono-chloropropane-1, 2-dio;l hydrolyzed vegetable prote ins; soy3-氯-1, 2-丙二醇 ( 3-MCPD )是繼二 英之后食此, 非常有必要對酸水解植物蛋白 (簡稱水解蛋白 )品安全方面出現(xiàn)的又一個熱點問題。它是一種毒性及醬油中的 3-MCPD 進行監(jiān)測。目前, 國內(nèi)外報道致癌物, 在劑量為 1 mg /kg時能夠使精子減少或使3-MCPD 的測定方法多為氣相色譜 /電子轟擊離子

9、-精子活性降低, 并有抑制雄性激素生成的作用, 使食質(zhì)譜法 (GC /EI-MS) 2- 3 , 采用氣相色譜 /負化學電用者的生殖能力減弱 1 。3-MCPD 對食品的污染最離-質(zhì)譜 (GC /NCI-M S)監(jiān)測分析 3-MCPD 的方法在初是在酸水解蛋白中發(fā)現(xiàn)的, 特別是存在于以酸水國內(nèi)尚未見報道。本文采用柱固相萃取技術(shù)對樣品解蛋白為原料的調(diào)味品 (如雞精和醬油等 )中。因中的 3-MCPD 進行提取凈化, 運用 GC /NCI-MS 選收稿日期: 2005-09-16通訊聯(lián)系人: 陳捷, 女, 高級工程師, Te:l ( 020 ) 38290355, Fax: ( 020) 3829

10、0325, E-ma i:l cjciq y ahoo. com. cn.基金項目: 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目 (No. K 026-2000).# 448#色譜第 24卷擇離子監(jiān)測 ( SIM )模式分析, 簡化了樣品前處理過程 , 提高了檢測靈敏度, 其檢測限比 GC /EI-MS 的選擇離子監(jiān)測法降低了一個數(shù)量級 4 , 方法快速,檢測結(jié)果準確、可靠。1 實驗部分1. 1 儀器及試劑Ag ilent 6890N 型氣相色譜-Agilent 5973N 型質(zhì)譜聯(lián)用儀, CI源檢測器 ( Agilent公司, 美國 ); 12通道半自動固相萃取裝置 ( Supe lco 公司,

11、美國 ); Ya-mato 8210 型水浴超聲波發(fā)生裝置 ( Branson 公司 ); 5810型離心機 ( Eppendorf公司, 德國 ); 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 ( He idolph 公司, 德國 ); 氮氣濃縮儀 ( Zy-mark公司, 美國 ); 渦流振蕩器 ( IFA公司, 美國 )和 M ill-iQ 去離子水發(fā)生器 (M illipore公司, 美國 )。3-MCPD 標準品: 純度 98%, F luka公司。衍生試劑: 七氟丁酰咪唑, 純度 9910%, F luka公司。乙酸乙酯、正己烷、甲醇均為色譜純 (M erck公司 ); 弗羅里硅土 ( 60 100目, Supe

12、lco公司 ), 無水硫酸鈉; 飽和氯化鈉溶液。3-MCPD 標準儲備液的配制: 準確稱取 3-MCPD 011 g, 加 5 mL 乙酸乙酯, 用正己烷定容至 100 mL, 其質(zhì)量濃度為 110 g /L。繪制校準曲線時用正己烷逐級稀釋儲備液, 得到系列標準工作液。固相萃取柱 (柱 A): W aters Aoisa-HBL 柱 ( 60mg, 3 mL), 使用前用 3 mL甲醇和 3 mL 水活化。凈化柱 (柱 B): 在 3 mL空柱管中加 018 g無水硫酸鈉, 中間加 110 g弗羅里硅土 ( 60 100 目, Su-pe lco公司 ), 上層再加 018 g無水硫酸鈉。1.

13、 2 樣品的制備1. 2. 1 樣品的準備稱取水解蛋白粉 5100 g, 加飽和氯化鈉溶液超聲溶解 5 m in, 定容至 10 mL, 備凈化提取用。醬油和水解蛋白液可直接用于凈化提取。1. 2. 2 樣品的提取稱取 015 g液體樣品, 或吸取 015 mL 水解蛋白粉稀釋液上樣于柱 A, 用固相萃取裝置真空抽濾 1 m in, 將柱 B接于柱 A下, 用 4 mL 乙酸乙酯-正己烷(體積比為 6B4)洗脫, 去掉柱 A, 再用 2 mL 乙酸乙酯-正己烷 (體積比為 6B4)淋洗柱 B, 收集洗脫液及淋洗液于 10 mL 具塞刻度離心管中, 在 40 e 下用氮氣將其濃縮至近干。1. 2

14、. 3 樣品的衍生將濃縮液用正己烷定容至 110 mL, 加 25 LL 七氟丁酰咪唑, 渦流振蕩 30 s, 于 70 e 下衍生反應 30 m in, 冷卻至室溫, 加 3 mL 水, 渦流振蕩 30 s, 靜置分層。將上層有機相轉(zhuǎn)移到自動進樣瓶 (裝試液前, 在自動進樣瓶中加 1 mm 厚的無水硫酸鈉 )中,供 GC-M S測定。1. 2. 4 空白樣品的制備以飽和氯化鈉溶液代替樣品, 其余按 / 1. 2. 20 節(jié)及 / 1. 2. 30節(jié)操作。1. 2. 5 系列標準溶液的制備吸取系列質(zhì)量濃度 ( 0100, 0110, 0120, 0150, 1100, 1010 Lg /L)的

15、標準溶液各 110 mL, 加 25 LL 七氟丁酰咪唑, 與樣品同時進行衍生化反應。1. 3樣品的測定1. 3. 1 色譜條件色譜柱: DB5-MS, 30 cm 0132 mm i. d.0125 Lm; 進樣口溫度: 250 e ; 傳輸線溫度: 150 e ;柱溫升溫程序: 于 70 e 下保持 1 m in, 然后以 10e /m in速度升至 150 e , 再以 20 e /m in 的速度升至 275 e ; 載氣: 氦氣; 無分流進樣, 進樣體積 1 LL。1. 3. 2 質(zhì)譜參數(shù)溶劑延遲: 6 m in; 電子倍增管電壓: 1 600 V; 負化學電離源溫度: 150 e

16、; 四極桿溫度: 150 e ; 反應氣: 甲烷; 電子倍增器、離子聚焦和入口透鏡參數(shù)均通過自動調(diào)諧設定; 選擇離子監(jiān)測模式。1. 3. 3 測定以 3-MCPD 的特征離子中信號響應高且無背景干擾的離子為定量離子, 外標法定量分析。以標準溶液的響應峰面積為縱坐標, 其濃度為橫坐標, 繪制標準曲線或計算回歸方程。依據(jù)測定的待測樣品的峰面積, 在標準曲線上查出 (或通過回歸方程計算 )樣品中 3-MCPD 的含量。2 結(jié)果與討論2. 1色譜分離將 1 Lg /L 的 3-MCPD 標準溶液衍生后進行 GC /MS 測定, 在負化學電離源下進行全掃描, 得到3-MCPD衍生物的總離子流色譜圖及質(zhì)譜

17、圖 (見圖1、圖 2 )。 3-MCPD 衍生物的特征碎片峰為 m /z213, 194, 179, 347, 375, 446, 482, 502, 其中m /z 502 為分子離子峰。負化學電離技術(shù)是通過將四極桿分析器的電壓反相, 使它能選擇負離子監(jiān)測而實現(xiàn)測定。在正化學電離模式下發(fā)生的所有反應在負化學電離模式下都可能發(fā)生。由于 3-MCPD 衍生物中含有多個鹵族元素, 在負化學電離源下極易捕獲甲烷釋放出的熱電子, 使其具有很高的檢測靈敏度。樣品中 1 Lg /L 濃度水平的 3-MCPD 衍生物在 EI源下進行全掃描檢測, 無法檢出 3-MCPD。第 5期陳捷, 等: 固相萃取-氣相色譜

18、 /負化學電離-質(zhì)譜法測定酸水解植物蛋白# 449#及醬油中的 3-氯-1, 2-丙二醇圖 13-氯-1, 2-丙二醇衍生物的總離子流色譜圖Fig. 1Total ion curren t chrom atogram of 3-m onochloro-propane-1, 2-d iol (3-MCPD ) derivative圖 23-氯-1, 2-丙二醇衍生物的全掃描質(zhì)譜圖F ig. 2Fu ll scan spectrum of 3-m onoch loropropan e-1, 2-diol (3-MCPD ) derivative2. 23-MCPD監(jiān)測離子的選擇從圖 2 可看出碎片

19、m /z 213, 194的離子強度較強, 但在實際樣品測定中, 基質(zhì)對其干擾非常大,因此選擇離子強度次之的 m /z 375, 446, 482, 502為 3-MCPD 的監(jiān)測離子, 其中m /z 482由 M (502) + C2 H5 ( 29) + 發(fā)生解離電子捕獲反應, CH2 Cl斷開, 生成碎片m /z 482。由于m /z 482的豐度穩(wěn)定,干擾小, 選擇其為定量離子, 降低了基質(zhì)的干擾, 提高了靈敏度。根據(jù)以上全掃描質(zhì)譜圖, 分別對相關(guān)的質(zhì)譜檢測參數(shù)進行優(yōu)化, 得到 3-MCPD 衍生物的選擇離子流色譜圖和質(zhì)譜圖 (見圖 3、圖 4)。2. 3 樣品處理條件的選擇及優(yōu)化由于

20、 3-MCPD既溶于水, 又溶于中等極性的有機溶劑, 故實驗中對幾種極性萃取柱和非極性萃取柱做了對比實驗。通過實驗, 本文選擇了 W aters公司 Aoisa-HBL 固相萃取柱 (60 mg, 3 mL)對樣品進行提取。在洗脫實驗中, 以正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、無水乙醚及它們與正己烷的混合溶液為洗脫液進行比較, 綜合考慮其凈化效果、回收率、溶劑用量及溶劑毒性等因素, 選擇了正己烷-乙酸乙酯為洗脫溶劑。固定洗脫液體積為 6 mL, 考察不同比圖 33-氯-1, 2-丙二醇衍生物的選擇離子流色譜圖F ig. 3 S elected ion m on itoring chrom ato

21、gram of 3-m ono-ch loropropan e-1, 2-diol (3-MCPD ) derivative圖 4 3-氯-1, 2-丙二醇衍生物的選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜圖Fig. 4 Selec ted ion m onitoring spec trum of 3-m ono-ch loropropan e-1, 2-diol (3-MCPD ) derivative例的正己烷-乙酸乙酯混合液洗脫對 3-MCPD 提取效率的影響, 結(jié)果見圖 5。由圖 5可知, 正己烷-乙酸乙酯的體積比為 4B6時, 3-MCPD 回收率達到最高,且趨于穩(wěn)定。圖 5 不同比例的正己烷-乙酸乙酯混合液

22、為洗脫液對3-氯-1, 2-丙二醇提取回收率的影響F ig. 5 E ffec t of hexane-ethyl acetate w ith d ifferent ratios on extraction recovery of 3-m onoch loropropan e-1, 2-diol與普通柱色譜法比較, 固相萃取法提取 3-MCPD 操作簡便, 成本低, 回收率得到提高, 且較為穩(wěn)定 (見表 1)。# 450#色譜第 24卷表 1 提取 3-MCPD 的兩種方法的比較 (n = 6) Table 1 Com parison of two m ethods for the ex tr

23、ac tion of 3-MCPD (n = 6 )ItemSPEColumnchromatographyAmount of solvent for activing column/mL380Am ount of eluent /mL6150Recovery spiked w ith 10 Lg /kg /%92- 9883- 912. 4 方法的檢出限、回收率和精密度在 0105 4010 Lg/L 范圍內(nèi), 3-MCPD 的峰面積 Y 與其質(zhì)量濃度 X (Lg /L)呈線性關(guān)系, 其線性回歸方程為 Y = 6. 761X + 91145 (r = 01999 8 )。以S /N = 3計,

24、 得 3-MCPD 的定性檢出限 (LOD )為 0. 1Lg /kg ; 以 S /N = 10計, 得 3-MCPD 的定量檢測限 (LOQ )為 0. 5 Lg /kg。分別在空白樣品中加入不同量的 3-MCPD, 混勻, 按前述方法處理樣品, 然后進行氣相色譜-質(zhì)譜測定, 分別計算回收率及其相對標準偏差 (RSD ), 結(jié)果見表 2。表 2方法的回收率和精密度 (n = 6)Table 2Recoveries and prec is ions of them ethod (n = 6)SampleAdded/( Lg /kg )Ave rage recov eryRSD /%(m ean ? SD ) /%Soy1. 092. 8 ? 10. 110. 9