腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像羅冬梅1，鄧小元1，卓雙木2，譚淑雯1，莊正飛1，金鷹1*（1.華南師范大學生物光子學研究院，廣州510631；2.福建師范大學醫(yī)學光電科學與技術重點實驗室，福州350007）摘 要：二次諧波的產生是一個二階非線性光學過程，這個過程只發(fā)生在中心對稱系數(shù)不為零的非中心對稱區(qū)域。利用二次諧波顯微技術可以對各種具有內源性信號的生物組織進行無損傷實時成像，如結締組織的膠原纖維或肌細胞的肌動球蛋白。在生物化學和結構生物學中，雖然DNA是由脫氧核糖核苷酸構成而蛋白質是由氨基酸殘基組成，但是DNA和蛋白質大分子高級結構的形成機制是相似的。本文利用光譜學成像技術對不同DNA樣品進行檢測，來獲取DNA樣品的SHG信號并進行高解析度成像。這些DNA樣品包括基因組DNA溶液、細胞核提取物以及培養(yǎng)細胞的細胞核。實驗結果表明在常規(guī)條件下可以獲得基因組DNA溶液和細胞核提取物的SHG信號，但幾乎觀測不到來自培養(yǎng)細胞核區(qū)的SHG信號。通過在培養(yǎng)基中添加少量無水乙醇（體積比小于5%），可以在培養(yǎng)細胞的細胞核區(qū)域檢測到SHG信號。我們推測在培養(yǎng)細胞中乙醇和DNA相互作用引起DNA分子構象發(fā)生變化，這些變化可能導致了DNA分子非線性光學性質的改變。關鍵詞：二次諧波發(fā)生；基因組DNA；細胞核提取物；培養(yǎng)腫瘤細胞；乙醇中圖分類號：O 433; Q 523文獻標識碼：ANonlinear spectral imaging of DNA specimens derived from tumor cells based on second harmonic generationLuo Dong-Mei1, Deng Xiao-Yuan1, Zhuo Shuang-Mu2, Tan Shu-wen1, Zhuang Zheng-Fei1, Jin Ying1*(1. College of Biophotonics of South China Normal University, Guangzhou 510631, China;2. Key Laboratory of Optoelectronic Science and Technology for Medicine of Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China)Abstract: Second harmonic generation (SHG) is a second-order nonlinear optical process that has symmetry constraints confining signal to regions lacking a center of symmetry. Using SHG microscopy, a variety of tissue structures have noninvasively been imaged by virtue of intrinsic signal generated by structured proteins such as collagen fibrils in connective tissues or the actomyosin lattice of muscle cells. In biochemistry and structure biology, the high-level structures of DNA and protein macro-molecules are similar in constructing mechanism, although DNAs consist of deoxynucleotides and proteins of amino acid residues. The principal purpose of present work is to detect the SHG signal from different DNA samples by spectral imaging technology based on two-photon excited fluorescence (TPEF) and SHG. These DNA samples include the solution of genomic DNA and extracted nuclei, and cultured living cells. Results show that we can obtain the SHG signal from solution of genomic DNA and extracted nuclei in routine condition, but nothing from cultured cell nuclei. After adding a little of absolute ethanol (less than 5% by volume) in culture medium, the SHG signal is detectable in the interest region of nuclei. The findings suggest that the interaction between ethanol and DNA in living cell gives rise to the shift of molecular conformation, and this shift change some nonlinear optical properties of DNA molecules.Key words: Second harmonic generation; genomic DNA; extracted nuclei; cultured tumor cell; ethanol雙光子激發(fā)熒光成像（Two-photon excited fluorescence imaging，TPEF）1是上世紀90年代發(fā)展起來的一種非線性顯微成像技術，它是一種基于細胞或生物組織中熒光團對兩個光子（具有雙倍于單光子激發(fā)波長）的同時吸收然后再發(fā)射的成像過程。由于雙光子激發(fā)只發(fā)生在焦點附近的極小區(qū)域，故無需共焦小孔（confocal pinhole）即可實現(xiàn)三維高分辨成像，可降低在光學成像中的熒光漂白效應，減少光化學毒性。其成像可采用近紅外的超快激光作為光源，組織吸收和散色效應小，具有成像深度深、對生物體損傷小、分辨率高等優(yōu)點。雖然TPEF成像具有一系列優(yōu)點，但它仍不能消除焦點內生物組織的光漂白和光損傷。近年來發(fā)展起來的二次諧波（Second harmonic generation, SHG）2成像技術克服了這一缺點，它利用超快激光脈沖與介質相互作用產生的倍頻相干輻射作為圖像信號來源，具有高分辨、高對比度的三維成像能力。在成像質量和光損方面有了顯著提高，是一種理想的非侵入生物活體的成像方法。其成像過程中無能量吸收，對生物體無光損傷和光致毒，且生物組織的許多內在結構無需外加分子探針即可產生較強的SHG信號，可消除染料致毒的影響。同時，二次諧波顯微鏡不受前向發(fā)射性質的限制，可以兩個方向收集信號，因此很容易與雙光子激發(fā)熒光顯微鏡TPEF、OCT（Optical coherence tomography）等聯(lián)合使用，進行成像比較，實現(xiàn)信號互補。SHG和TPEF的激發(fā)強度與激發(fā)光的平方成正比，兩種顯微方法的空間分辨率相當，意味著能夠從同一裝置上得到這兩種信號的對照模式，除了使用不同的濾光片外，二次諧波顯微成像和雙光子激發(fā)熒光顯微成像在系統(tǒng)結構上完全兼容。近年來，二次諧波-雙光子（SHG-TPEF）聯(lián)合成像技術已經被廣泛應用于生物組織和細胞的研究3-5。 二次諧波技術很早就被應用于生物組織成像6。其后，在多種生物組織中都可檢測到SHG信號，如角膜7 、鼠尾肌腱8和牛的I型Achilles腱、人的皮膚9等。此外，手性分子如核酸（DNA或RNA）、蛋白質、糖元、淀粉、纖維素、磷脂等都具有手性，而它們的單體如核苷酸、氨基酸等，也都是手性分子，手性分子具有非中心對稱的結構，可以產生SHG信號，因此對核酸進行二次諧波顯微成像成為可能。早期研究表明，在商品化的DNA樣品10和經過固定處理的前列腺癌細胞樣品11中檢測到了DNA產生的SHG信號。本文以體外培養(yǎng)的腫瘤細胞為實驗對象，應用光譜成像技術對新鮮提取的基因組DNA、細胞核提取物和培養(yǎng)狀態(tài)的腫瘤細胞進行光譜學成像，在此基礎上討論乙醇對DNA構象可能存在的潛在影響。1材料與方法1.1 實驗裝置實驗裝置使用多光子激光掃描共聚焦顯微成像系統(tǒng)（Fig.1）。該系統(tǒng)由飛秒激光系統(tǒng)、掃描顯微系統(tǒng)、探測系統(tǒng)三部分組成。飛秒激光系統(tǒng)由高能量的二極泵源固體激光器(VerdiV-10)作為激發(fā)光源、美國Coherent公司生產鎖模鈦寶石(Ti：Sapphire Laser，Mira-900F)作為激光工作物質和聲光調制器(AOM)三部分組成。聲光調制器（AOM）用來調節(jié)激光的功率，激光的偏振方向為水平偏振，光纖耦合。波長可調協(xié)范圍為700nm980 nm，脈沖寬度約為110 fs，重復頻率 76 MHz。掃描顯微系統(tǒng)是由德國Zeiss公司生產的LSM510 Axiovert 200倒置激光掃描共聚焦顯微鏡，實驗所用探測系統(tǒng)配置的是META探測器。圖1 多通道非線性光學實驗裝置原理圖Figure1 Schematic of multimode nonlinear optical imaging system鈦寶石飛秒激光器發(fā)出的超短脈沖激光通過聲光調制器（AOM）后到達雙光子激光掃描顯微鏡作為激發(fā)光，經過主二向色性光束分束器（MDBS）由油浸物鏡（63，N.A.=1.4）聚焦到樣品上，樣品在基頻光激發(fā)下產生背向二次諧波再經油浸物鏡收集，經過紅外光束濾色片（IR Block：Zeiss KP650）濾除漫反射的基頻光后將激發(fā)光輸送到META探測器，由探測器探測后轉變?yōu)殡娦盘杺鬏斨劣嬎銠C。實驗探測系統(tǒng)配置了META探測器，它是由一個高質量的反射光柵和一個32通道的光電倍增管（photomultiplier tube, PMT）陣列組成。該系統(tǒng)有多通道成像模式和光譜成像模式兩個成像模式，這兩個成像模式均使用META探測器獲取圖像。其中多通道成像模式有八個獨立的通道，通過設置相應的參數(shù)可檢測樣品382714nm波段的發(fā)射光信號并得到該波段的光學二次諧波-雙光子二維圖像；光譜成像模式可以記錄相應波段的光學二次諧波-雙光子熒光圖像的光譜。本文結合這兩種成像模式獲取樣品的多通道非線性二次諧波-雙光子圖像及其相應的光譜。1.2 樣品制備人肝癌細胞系BEL-7402（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心），37快速復蘇，洗滌后接種于含生長在含10%胎牛血清，100U/mL 的青霉素及鏈霉素的DMEM(Gilbco Invitrogen)完全培養(yǎng)液中，37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀況更換培養(yǎng)液或進行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）進行消化，經洗滌后，每培養(yǎng)瓶（25ml）的接種量約為1105個細胞。收集處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞用于基因組DNA和細胞核的提取。用于SHG成像的培養(yǎng)腫瘤細胞提前一天接種于共焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿（NEST, GBD-35-15）。根據(jù)操作手冊，利用組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒(Dongsheng, Guangzhou, China)提取腫瘤細胞的基因組DNA；利用組織/細胞細胞核快速提取試劑盒(Solarbio, Beijing, China) 提取腫瘤細胞的細胞核。1.3 SHG成像 實驗前首先開啟激光器和顯微鏡，激光器預熱約兩小時穩(wěn)定工作后開始實驗。分別將實驗樣品置于顯微鏡下進行觀察，首先找到樣品分散良好的視野，將熒光顯微鏡轉到掃描的位置，然后不斷縮小掃描范圍，以獲得完整清晰的圖像，觀察目標樣品的細微結構。選擇兩個通道來采集和記錄被檢測樣品的二次諧波-雙光子熒光信號獲得該樣品的二次諧波-雙光子熒光成像圖像。系統(tǒng)自帶工具調焦平臺(HRZ 200 stage, Carl Zeiss)用來改變焦點的位置，得以在不同區(qū)域處成像。用ROI工具獲取各個區(qū)域處二次諧波信號的光強分布，用Histo工具獲得各個區(qū)域處二次諧波信號的平均光強。從382nm處(設定后保持不變)開始掃描，每增加10nm掃描一次直到沒有信號，獲得了不同波長處的二次諧波-雙光子熒光成像，與此同時光譜成像模式記錄相應的光譜。LSM 510 Image Examiner軟件處理獲得的圖像，調整圖像的對比度、亮度對圖像進行進一步的處理以期獲得較好的圖像。2 結果2.1 基因組DNA溶液的發(fā)射光譜經紫外分光光度計測量，基因組DNA溶液的濃度為30g/ml，A260/A280=1.90，符合實驗要求。圖2為實驗中得到的肝癌細胞基因組DNA的二次諧波-雙光子熒光發(fā)射光譜。實驗中使用激發(fā)光波長為800nm、功率為10mW的飛秒激光對肝癌細胞DNA進行掃描，光譜信號變化范圍為382714nm。從圖中可以看出基因組DNA溶液在404nm和639nm處各有一個波峰，其中404nm處的波峰是來自于SHG的信號，639nm處的波峰是來自于TPEF的信號。該DNA樣品的光譜學成像在整個掃描窗口中顯示為均質的背景，表明DNA分子在溶液中均勻分布（結果未顯示）。圖2 基因組DNA溶液的二次諧波光譜Figure 2 SHG-TPEF Spectra of genomic DNA solution2.2 細胞核提取物的成像與光譜 為了獲得肝癌細胞核提取物的二次諧波信號，實驗中對提取出來的肝癌細胞核進行了二次諧波-雙光子成像掃描并作出了相應的發(fā)射光譜圖。圖3（a）和圖3（b）是肝癌細胞核提取物雙光子二次諧波成像，圖3（c）是相應的發(fā)射光譜。其中圖3（b）的掃描區(qū)域是圖3（a）掃描區(qū)域的4.5倍，即放大了4.5倍。實驗中激發(fā)光波長、激發(fā)功率及光譜信號變化范圍同上(2.1)。從圖3（a）和圖3（b）中可以看出肝癌細胞核提取物具有很強的二次諧波信號，相應的光譜圖也顯示肝癌細胞核提取物的SHG-TPEF信噪比較高。 圖3 細胞核提取物的二次諧波-雙光子熒光成像（a, b）及其相應的發(fā)射光譜（c）Figure 3 SHG-TPEF imaging of the extraction of the hepatocellular carcinoma cells (HCC) nuclei (a, b) and the corresponding emission spectra(c)2.3 培養(yǎng)細胞的SHG/TPEF成像在未改變任何實驗條件的情況下，用同樣的方法對培養(yǎng)狀態(tài)下的腫瘤細胞的細胞核區(qū)域進行光譜掃描時，幾乎無法獲得可以識別的SHG信號?？紤]到基因組DNA和細胞核提取過程中廣泛使用有機溶劑可能是造成DNA分子光學特性改變的因素，因此嘗試在實驗中向細胞培養(yǎng)液中添加少量的無水乙醇，具體步驟是：在培養(yǎng)液中滴入4滴無水乙醇溶液（體積比5%），約3分鐘后進行光譜掃描。圖4（a）和圖4（b）分別為不添加乙醇的肝癌細胞和添加了無水乙醇的肝癌細胞的二次諧波-雙光子成像，圖3(c)為對應的光譜圖。從圖(a)和圖(b)中可以看出添加了乙醇的肝癌細胞的二次諧波-雙光子成像明顯強于未添加乙醇的肝癌細胞的二次諧波-雙光子成像,相應的光譜顯示未添加乙醇的樣品無SHG信號，添加乙醇的樣品在激發(fā)光的半波長404nm處有波峰，此為SHG信號。 圖4肝癌細胞的二次諧波-雙光子成像 (a)和添加乙醇的肝癌細胞的二次諧波-雙光子成像(b)及其相應的發(fā)射光譜(c)Figure 4 SHG-TPEF images from the HCC (a) and the HCC of adding ethanol (b), the corresponding emission spectra are shown in (c).The red box is the region of interest of nuclei of the cell, six regions of interest are detected in (a) and eight regions of interest are detected in (b), the corresponding spectra are separately made according to the average of these regions of interest in (a) and (b)3 討論二次諧波-雙光子共聚焦顯微技術是近年來發(fā)展起來的觀察微觀世界和生物細胞結構的有力工具。它最大的優(yōu)點探測深度深，對生物體的損傷小，時間空間分辨率高以及對結構的對稱性敏感等12-13。我們采用二次諧波-雙光子共聚焦顯微技術對三組DNA樣品進行觀察，實驗結果顯示在常規(guī)條件下即可觀測到基因組DNA和細胞核提取物的SHG信號，但卻未檢測到培養(yǎng)細胞細胞核區(qū)的SHG信號，當在培養(yǎng)基中添加了少量無水乙醇后可觀測到其SHG信號。由于DNA大分子具有非中心對稱的手性結構12，且其反向平行的雙螺旋結構造成的準相位匹配（Pseudo-phasematching）使其能夠產生二次諧波10，因此可被作為產生SHG的標本。早期的研究發(fā)現(xiàn)，在商品化的DNA樣品10和經過固定處理的前列腺癌細胞樣品11中檢測到了DNA產生的SHG信號，其中Sheppard10等人利用SHG顯微成像觀察到了鯡魚精DNA在蒸餾水中的SHG成像， 而莊正飛11等人則利用SHG-TPEF顯微成像技術獲得了前列腺組織細胞細胞核切片的SHG信號。本實驗2.1和2.2的DNA樣本均來自新鮮培養(yǎng)的腫瘤細胞，實驗結果再次說明了基因組DNA和細胞核均可以產生較強的SHG信號。2.1的光譜圖中在639nm處還有一個波峰，這是來自于卟啉及其衍生物的TPEF信號14-15，細胞中的細胞色素、血紅素等生物大分子均含有卟啉，卟啉可以與DNA結合并發(fā)生相互作用16-17，故可能是在DNA提取過程中細胞中的卟啉大分子與DNA結合很難被完全洗脫殘留在DNA溶液中造成在639nm處有一個波峰。2.2的光譜圖中SHG-TPEF信噪比較2.1高，由于在真核生物，DNA以非常致密的形式存在于細胞核內，能夠以多種形態(tài)（超螺旋和環(huán)形等）構象存在于細胞核中，而基因組DNA是以線性雙鏈存在于溶液中，其DNA致密程度遠低于細胞核DNA，故基因組DNA的SHG-TPEF信噪比較細胞核提取物的SHG-TPEF信噪比低。理論研究表明，二次諧波的產生必須滿足兩個條件，一是介質必須具有非中心對稱結構(Non-centrosymmetric structures)，二是必須滿足相位匹配（Relaxed phase matching）的條件3-4,18。2.1 和2.2 驗證了DNA分子是能夠滿足發(fā)生的條件的，但從2.3 （a）可以看出在常規(guī)培養(yǎng)的腫瘤細胞的核區(qū)幾乎無法檢測到DNA的SHG信號，但加入乙醇后（唯一的條件改變）卻可以觀察到其SHG，推測可能是乙醇誘導活細胞內DNA構象發(fā)生了變化致使DNA的非線性光學特性發(fā)生改變從而使得變構后的DNA滿足了產生SHG的條件，并最終探測到了其SHG信號。目前，關于乙醇誘導溶液中DNA分子構象之間的轉變已經被廣泛研究19-22，加入乙醇到DNA溶液中使溶液中水活性降低，致使結合到DNA上的水分子數(shù)減少，原來被水分子支撐而伸展的DNA溝槽收縮，大溝槽變得更窄更深，小溝槽變得更寬更淺，使DNA整體外形結構變得更短，從而導致DNA構象由B型轉化為A型，這種構型的轉變將改變雙螺旋結構中大溝槽和小溝槽的氫鍵類型23-25。在體內，這種類型的影響取決于與DNA結合的蛋白質14-15,18。研究表明，DNA隨著乙醇濃度的增大穩(wěn)定性會降低22，推測當加入乙醇到培養(yǎng)的細胞中，乙醇小分子會通過核孔進入到細胞核內，致使DNA的穩(wěn)定性降低從而使DNA與蛋白質的結合松散，使雙鏈處于較松散的狀態(tài)，有利于DNA與RNA的結合致使構象發(fā)生改變。在活細胞中，由于細胞本身不滿足非中心對稱結構，每個核苷酸分子產生的二次諧波相互疊加抵消使得我們在實驗中并未觀測到SHG的產生。加入乙醇分子后，分子表面電荷特性發(fā)生改變以及分子螺旋構象形態(tài)發(fā)生改變，使得每個分子在同樣入射光的激發(fā)下所產生的超級化強度的方向與之前相比發(fā)生改變，進而每個分子產生的二次諧波的方向也發(fā)生改變，在我們觀察的生物組織區(qū)域內，所有的二次諧波相位一致而相互干涉加強，滿足相位匹配原理18，使得我們在加入乙醇后觀察到了SHG。由此，反推2.1和2.2的實驗結果，由于在提取基因組DNA和細胞核的試劑中包含了乙醇，推測提取過程中乙醇的加入也會影響DNA的構象，對二次諧波的產生和增強造成一定的影響。此外，加入乙醇分子后細胞的熒光強度也明顯增強（圖3）。其原因可能是由于乙醇介入蛋白質分子，改變蛋白質分子所處環(huán)境的介電常數(shù)，引起肽鏈伸展，從而降低了某些氨基酸如色氨酸（Trp）、酪氨酸(Tyr)殘基的微環(huán)境極性，使得Tyr殘基形成的氫鍵遭到破壞，以致處于淬滅狀態(tài)的Tyr殘基熒光得以恢復，并使其量子率增加。另外可能的原因是加入乙醇可使細胞起到脫水作用，降低細胞所處的微環(huán)境極性，使得熒光強度增強。4 結論 我們利用SHG-TPEF顯微成像技術分別對基因組DNA、細胞核提取物和培養(yǎng)細胞進行光譜成像，結果顯示常規(guī)條件下可檢測到基因組DNA和細胞核提取物的SHG，但無法檢測到培養(yǎng)細胞的SHG，乙醇的加入可使得我們在培養(yǎng)細胞中也檢測到SHG， 表明乙醇可對DNA的空間構象產生影響，致使DNA光學特性發(fā)生改變從而產生二次諧波。由此，反推在基因組DNA和細胞核提取試劑中包含了有機物乙醇，可能對這兩組樣品的DNA空間構象產生影響，并最終影響二次諧波的產生和增強。同時，在DNA和細胞核的提取試劑中還包含了其它的化學試劑（如十二烷基硫酸鈉：SDS，乙二胺四乙酸二鈉鹽：EDTA等）也有可能對DNA非線性光學特性產生影響，要得出確切的結論還需要更進一步的研究。References:1 Denk W, Stickler H, Webb W W. 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