克隆性基因重排在淋巴瘤診斷中的應(yīng)用,分子和細(xì)胞遺傳學(xué)異常,抗原受體基因的克隆性重排 與類型相關(guān)的染色體異常,簡(jiǎn)要原理 檢測(cè)方法 應(yīng)用和策略 注意事項(xiàng),淋巴細(xì)胞表面受體,IG： IGH （14q32) IGL (2q12) (22q11) TCR: TCR 14q11 TCR 7q32 TCR 7p15 TCR 14q11.2,IG和TCR基因結(jié)構(gòu)及重排過程,胚系,各區(qū)片段數(shù)多 重排的多樣性 抗體多樣性,淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中基因重排順序,IG: H重排: IgH/ 缺失 ： IgH/ TCR: ：TCR ：TCR ,淋巴瘤中基因重排形式 克隆性重排,不同的淋巴細(xì)胞 相同的重排形式 淋巴細(xì)胞單克隆性增生 淋巴瘤診斷和鑒別診斷的分子指標(biāo),克隆性重排的檢測(cè)方法,Southern 雜交 PCR法,特異性探針： 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段,Southern 雜交,優(yōu)點(diǎn)： 敏感性較高 可靠性高 缺點(diǎn)： DNA量多（10ug) 新鮮組織 操作復(fù)雜 時(shí)間長(zhǎng)、成本高 放射性同位素 逐漸被PCR方法替代,PCR法,原理: VDJ重排 后相互靠攏，用適當(dāng)?shù)囊锟蓴U(kuò)增出重排片段,新鮮、凍存、石蠟、顯微切割或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本， 不受DNA片段的影響，僅需要少量的DNA， 時(shí)間短，敏感性高， 是目前最常用的克隆性重排的檢測(cè)方法。,引物的選擇原則,引物位置：PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度10-15bp 引物本身的長(zhǎng)度25bp 精確地將所有VDJ基因片段撿出 家族性引物或通用引物 不同的組合具有互補(bǔ)性，提高陽性率 引物數(shù)目和同源性之間平衡,該協(xié)作研究由47個(gè)研究所組成7個(gè)網(wǎng)絡(luò)和一個(gè)病理panel。它由分子生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)等領(lǐng)域的專家。 1998.6-2002.7， 12次國(guó)際性會(huì)議。 主要目的： （1）開發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)化PCR實(shí)驗(yàn)操作和PCR引物 （2） 評(píng)價(jià)和應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)化方法,BMH4CT983936的歐洲BIOMED2 協(xié)作研究,設(shè)計(jì)了一套完整的引物和方法用于IG和TCR基因重排的克隆性分析，共有14管97對(duì)引物 IGH（A,B,C,D,E 5管） IGK（A，B 2管） IGL（1管） TCRB（A，B，C 3管） TCRG（A，B 2管） TCRD(1 管) Van Dongen JJM et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the Biomed-2 concerted action BMH4-C98-3936 Leukemia 2003;17:2257-2317,所有引物采用相同的擴(kuò)增條件和檢測(cè)方法，并具有很高的敏感性和特異性， 已被推薦為可疑淋巴組織增生性疾病克隆性分析的標(biāo)準(zhǔn)方法，試劑已商品化 /,PCR產(chǎn)物分析方法,克隆性重排判斷基本原則： 條帶在期望的堿基大小范圍內(nèi)；一條或兩條 帶寬不超過1mm, 邊緣整齊； 多克隆性： 無特異性條帶，彌散帶或梯狀帶,聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)-異源雙鏈分析,+,-,2. 毛細(xì)管電泳基因掃描（genescan）,單克隆性細(xì)胞產(chǎn)生一個(gè)或兩個(gè)尖的峰，多克隆為多個(gè)小峰，呈Gaussian分布。 （本課題組曾用兩種方法分析180管皮膚淋巴瘤的TCR基因重排，兩者的符合率為96.7%, 在TCRB用genescan方法稍敏感，在TCRD用PAGE更特異。）,對(duì)照的設(shè)立,陽性對(duì)照 陰性對(duì)照,內(nèi)對(duì)照: 3個(gè)病例的內(nèi)對(duì)照b-actin均為陽性,對(duì)照的設(shè)立,克隆性基因重排的應(yīng)用,診斷與鑒別診斷 譜系確定 分期 克隆相關(guān)性判斷,（1）形態(tài)和IHC不能得出肯定結(jié)論的淋巴組織增生性病變 胃腸道、肺、涎腺、甲狀腺、眼眶等部位的MALT淋巴瘤 濾泡性淋巴瘤、皮膚淋巴瘤和T細(xì)胞淋巴瘤 形態(tài)不典型，缺乏特異性標(biāo)記,CP2170, 66M, 胃黏膜活檢 CP2171, 43F, 左腮腺腫塊,明顯的漿樣分化細(xì)胞,CP2170 ： FR1 (+), FR2(+), FR3(+) 診斷： （胃）小B細(xì)胞淋巴瘤，傾向MALT邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤 CP2171： FR1 (+), FR2(+), FR3(-) 診斷：（左腮腺）符合MALT邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤,（2） 形態(tài)和免疫組化均可考慮為淋巴瘤 但部位少見或發(fā)病年齡不典型 基因重排克隆性分析可增加診斷的依據(jù),54M, 舌跟部腫塊， PTCL 1M, 左頸雞蛋大腫塊, PTCL? 17 F, 右頸部淋巴結(jié) FL 38M, 左頸部淋巴結(jié) AILT,17F, 右頸淋巴結(jié)腫大,- + - + - + - +,CD20,Bcl-2,3. 組織小或無法取得組織病變的診斷,深部腫塊的穿刺或活檢標(biāo)本如胃鏡標(biāo)本 無明顯腫塊，僅表現(xiàn)為胸腹水 但要特別注意細(xì)胞的量,52M ， 左眼內(nèi)吸取物 細(xì)胞涂片檢查：見惡性腫瘤細(xì)胞，小圓細(xì)胞腫瘤，傾向淋巴瘤 基因重排：FR1(+), FR2(+), FR3(-),(4) 淋巴瘤譜系的判斷 T or (富于T) B? T or NK/T? , T or -T ?,34M, 右面部腫脹5月，CD56-, TIA+, PE+, EBER+, TCRr (-), TCRb (-),內(nèi) 1 2 12,TCR(-) TCR(-),CD56,EBER,(5） 比較兩個(gè)淋巴瘤克隆性的相關(guān)性， 或區(qū)別復(fù)發(fā)和第二原發(fā)腫瘤。 組織細(xì)胞/樹突細(xì)胞肉瘤- ALL, T淋母 ( 6） 外周血和骨髓累及情況,MRD理想的檢測(cè)方法： 活檢組織的PCR產(chǎn)物克隆， 對(duì)連接區(qū)進(jìn)行測(cè)序， 再設(shè)計(jì)病人特異的引物做real-PCR進(jìn)行MRD的評(píng)價(jià),應(yīng)用策略,采用所有引物組，工作量大，不實(shí)用，沒有必要， 有交叉和重疊 合理的應(yīng)用策略以最少的引物組最大可能地檢測(cè)克隆性,Suspected B-cell Proliferations,Suspected Lymphoid Proliferations of unknown origin (B or T),Suspected T-cell Proliferations,TCR+ Proliferations or immature T-cell,IGH (VH-JH),IGK,Preferably with,No clonality but still suspected,IGH (DH-JH),Preferably with,IGL,Clonal (generally multiiple Clonal results),Clonal,No evidence of clonality,TCRB,Preferably with,TCRG,TCRG,TCRD,and,Results should be considered in the context of all available clinical, histological and immunophenotypic data,Van Krieken, et al. Leukemia 2007;21:201-206,Suspected B-cell Proliferations,Suspected Lymphoid Proliferations of unknown origin (B or T),Suspected T-cell Proliferations,IGHB+IGKA+B,Preferably with,No evidence 0f presence of clonal B/T population in the samele,IGHB+IGKA+B,IGHA+C+D,IGL+IGHE,TCRGA+B,TCRBA+B,TCRBA+B+C,TCRBc +TCRD,TCRBC+TCRD,TCR TCR,If not clonal,If not clonal,If not clonal,Liu et al. British J Haematol 2007;138：31-43,Lineage unknown,1. 克隆性不等于惡性： 有些良性病變有時(shí)也有克隆性重排 CD8+（有時(shí)CD4+) T 細(xì)胞增生癥 良性單克隆性r球蛋白病 EBV陽性的淋巴細(xì)胞增生 （AILT) 自身免疫性疾病(Sjogren 綜合癥,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎) 免疫缺陷狀態(tài)(先天性,移植后,HIV感染) 免疫調(diào)節(jié)異常疾?。–astleman 病） 皮膚異常病變（淋巴瘤樣丘疹病，急性苔蘚樣糠疹）,結(jié)果的解釋和注意事項(xiàng),30例LyP病例TCR基因重排總體陽性率80% 20例CALCL病例TCR基因重排總體陽性率100%， 兩組病例TCR基因重排陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P0.05) 表明TCR基因重排在LyP和CALCL的鑒別中無應(yīng)用價(jià)值。,必須結(jié)合臨床病史,Ig和TCR基因重排不一定是譜系的標(biāo)志： 某些T、B淋巴瘤有基因重排的交叉,T,B之間：不成熟的T或B相對(duì)頻繁 TCRab, TCRrd之間,少量淋巴細(xì)胞 小標(biāo)本或高負(fù)荷B細(xì)胞淋巴瘤中有少量反應(yīng)性T細(xì)胞 EBV或CMV感染 免疫抑制患者 淋巴結(jié)或外周血中TCR的某些組分重排占優(yōu)勢(shì),重排多樣性受限制,可出現(xiàn)寡克隆信號(hào)。 假克隆和寡克隆信號(hào)表現(xiàn)：弱條帶或兩條以上條帶 辨別方法： 多次重復(fù)，大小不同的條帶 只有那些可重復(fù)的相同大小的條帶是可信的單克隆性條帶,3. 假克隆和寡克隆,淋巴瘤重排檢出率不是100%假陰性 原因： （1）早期未完成重排；有些類型淋巴瘤缺乏基因重排 （2）引物不全 （3）與其