第八講 疫苗及其分類,疫苗（vaccine）,凡接種機(jī)體后能產(chǎn)生自動免疫和預(yù)防疾病的一類生物制劑均稱為疫苗. 細(xì)菌性菌苗 病毒性疫苗 寄生蟲性蟲苗 治療性疫苗（腫瘤、過敏和一些傳染性疾?。?生理調(diào)控疫苗（如促進(jìn)生長和控制生殖等）,根據(jù)疫苗抗原的性質(zhì)和制備工藝，疫苗又分為 活疫苗（live vaccine） 死疫苗（killed vaccine） 基因疫苗（genetic vaccine）,一種疫病究竟以哪類疫苗最為有效可行，取決于該疫病特點(diǎn)，包括流行病學(xué)、病原理化特性、致病機(jī)理和免疫特點(diǎn)以及各種技術(shù)手段是否可行。,活疫苗,活疫苗可以在免疫動物體內(nèi)繁殖； 能刺激機(jī)體產(chǎn)生全面的系統(tǒng)免疫反應(yīng)和局部免疫反應(yīng)； 免疫力持久，有利于清除局部野毒； 產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低。 有毒力增強(qiáng)和返祖危險(xiǎn)； 有不同抗原的干擾現(xiàn)象； 要求在低溫、冷暗條件下運(yùn)輸和儲存。,死疫苗,死疫苗不能在免疫動物體內(nèi)繁殖，比較安全，不發(fā)生全身性副作用，無毒力返祖現(xiàn)象； 有利于制備多價(jià)或多聯(lián)等混合疫苗； 制品穩(wěn)定，受外界環(huán)境影響小，有利于保存運(yùn)輸。 疫苗免疫劑量大，生產(chǎn)成本高，需多次免疫 只能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和免疫記憶，故常需要用佐劑或攜帶系統(tǒng)（deliver system）來增強(qiáng)其免疫效果。,基因疫苗,基因疫苗不能在機(jī)體增殖，但它可被細(xì)胞吸納，并在細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)合成疫苗抗原 體液免疫 細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng),活疫苗 可在宿主細(xì)胞中復(fù)制 毒力降低 免疫反應(yīng)比較全面 免疫劑量小 免疫保護(hù)期長,死疫苗 不能在宿主細(xì)胞 中復(fù)制 無毒，不返強(qiáng) 免疫反應(yīng)不太全 面 不會傳染給其它 個體 制備技術(shù)相對容 易,DNA疫苗 可刺接抗原在細(xì) 胞內(nèi)合成 可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫 制備技術(shù)容易標(biāo) 準(zhǔn)化,不 同 疫 苗 特 性 比 較,疫 苗 研 究 技 術(shù),活疫苗 經(jīng)典策略-病毒 重組病毒 重組病毒載體 經(jīng)典策略-細(xì)菌 重組細(xì)菌 重組細(xì)菌載體,死疫苗 完整病原體疫苗 蛋白基礎(chǔ)疫苗 肽基礎(chǔ)疫苗 多糖基礎(chǔ)疫苗 抗獨(dú)特型疫苗,DNA疫苗 “Naked” DNA Viral delivery Bacterial delivery,弱毒疫苗（attenuated vaccine）,微生物自然強(qiáng)毒株通過物理、化學(xué)或生物的連續(xù)傳代和篩選培育而成或從自然界篩選的具有良好免疫原性的自然弱毒株，經(jīng)培養(yǎng)增殖后制備的疫苗 喪失或減弱對原宿主動物致病力，但仍保存良好免疫原性和遺傳特性的毒株,重組活疫苗 （recombinant live vaccine）,通過基因工程技術(shù)，將病原微生物致病性基因進(jìn)行修飾、突變或缺失，從而獲得弱毒株。 由于這種基因變化，一般不是點(diǎn)突變（經(jīng)典技術(shù)培育的弱毒株基因常為點(diǎn)突變），故其毒力更為穩(wěn)定，返突變機(jī)率更小，如豬偽狂犬病基因缺失疫苗。,基因工程活載體疫苗 （genetic engineering live vector vaccine）,將致病性微生物的免疫保護(hù)基因插入到載體病毒或細(xì)菌（通常為疫苗毒（菌）株）的非必需區(qū)，構(gòu)建成重組病毒（或細(xì)菌），經(jīng)培養(yǎng)后制備的疫苗。 該類疫苗不僅具有活疫苗和死疫苗的優(yōu)點(diǎn)，而且對載體病毒或細(xì)菌以及插入基因相關(guān)病原體的侵染均有保護(hù)力。 同時(shí)，一個載體可表達(dá)多個免疫基因，可獲得多價(jià)或多聯(lián)疫苗。,病毒復(fù)制非必需片段基因鑒定 病毒復(fù)制非必需片段基因克隆 外源基因插入非必需片段基因中間(即重組載體) 將病毒基因和重組載體基因共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，同源重組，產(chǎn)生感染性病毒粒子 篩選穩(wěn)定的重組病毒,重組病毒,重 組 病 毒 載 體,痘病毒載體 (fowlpox, canarypox) 皰疹病毒載體 桿狀病毒載體 腺病毒載體 RNA病毒 NDV， PRRSV，Poliovirus Sindbis virus (Alphaviruses),宿主范圍廣、增殖滴度高、穩(wěn)定性好、基因組容量大、含多個非必需區(qū)基因，易于構(gòu)建和分離重組病毒，適于插入多個外源基因(40kb)，對插入的外源基因有較高的表達(dá)水平。 抗原性穩(wěn)定，免疫原性持久，能夠同時(shí)誘發(fā)體液和細(xì)胞免疫，相對安全。 痘苗病毒在種痘后局部反應(yīng)較大，在人接種后有百萬分之一發(fā)生全身性發(fā)痘和種痘后腦炎等并發(fā)癥傾向。 雞痘病毒、金絲雀痘病毒、豬痘病毒、羊痘病毒、兔痘病毒 禽類痘病毒，由于用該病毒接種哺乳動物后，可以引起頓挫型感染，但卻可以持續(xù)表達(dá)外源基因，并且不影響再次接種。（雞痘病毒）,痘 病 毒 載 體,痘病毒載體中表達(dá)的外源基因,HIV gag/pol ， core，gp160 ，env NDV HA/NA，F(xiàn)usion， Fusion/HA/NP PRV gp50/gp63 ,gp50/63/I/X Measles F/HA ,Fusion Rabies G Influenza HA IBDV VP2 FLV env ,人Ad2和Ad5 ：外源基因容量為20kb左右。 E3：病毒復(fù)制的非必須區(qū)，允許插入的外源基因的最大長度為4.0Kb。外源基因一般不需要加基因表達(dá)調(diào)控元件，利用腺病毒本身的調(diào)節(jié)元件，即外源基因可插在E3啟動子后,在感染早期有效表達(dá)。HIV-1、狂犬病毒 E1：為病毒復(fù)制必須區(qū)。缺失E1區(qū)的人腺病毒必須在特殊的工程細(xì)胞中（比如293細(xì)胞系（人胚腎細(xì)胞）或非缺失的腺病毒輔助下才能復(fù)制增殖，因此稱為病毒缺陷型載體。,腺 病 毒 載 體,腺 病 毒 載 體 優(yōu)點(diǎn),腺病毒比較安全。 腺病毒的靶細(xì)胞范圍廣: 復(fù)制分裂細(xì)胞、非復(fù)制分裂細(xì)胞。 腺病毒容易制備，對熱不敏感，高滴度增殖。 腺病毒可以在腸道及呼吸道繁殖，能誘導(dǎo)粘膜免疫，能制成 藥囊經(jīng)口服途徑接種以預(yù)防消化道及呼吸道感染。 Ad2、Ad5等啟動子較強(qiáng)，能高水平表達(dá)外源基因，特別是換 以更強(qiáng)的啟動子如CMV早期啟動子后，更可明顯提高外源基 因的表達(dá)水平。,基因組較大，約150kb，含70個編碼基因，其中至少20%的基因是非必需基因，可容納多個外源基因的插入。 大多數(shù)皰疹病毒的宿主范圍很窄，其重組病毒的使用不會產(chǎn)生流行病學(xué)方面的不良后果(偽狂犬病毒除外) 。 許多皰疹病毒經(jīng)粘膜途徑感染，構(gòu)建的載體活疫苗可經(jīng)粘膜途徑提呈抗原，誘導(dǎo)特異性粘膜免疫。 皰疹病毒作為活載體表達(dá)外源基因作為疫苗的研究：單純皰疹病毒、偽狂犬病毒、火雞皰疹病毒、牛皰疹病毒I型、馬皰疹病毒I型、傳染性喉氣管炎病毒,皰 疹 病 毒 載 體,重經(jīng)典策略-細(xì)菌 相對較難 重組細(xì)菌 比重組病毒困難 重組細(xì)菌載體 粘膜免疫,活 細(xì) 菌 疫 苗 研 究 技 術(shù),格氏鏈球菌 、木糖鏈球菌：人的皮膚共棲菌，可作為表面定居的融合蛋白載體 乳酸桿菌：腸道和陰道內(nèi)的共棲菌，但出現(xiàn)時(shí)間很短。 腸道菌（大腸桿菌、霍亂弧菌、結(jié)腸耶耳森氏菌、志賀氏菌） 大腸桿菌/TGEV S蛋白的融合蛋白，CS31A: 腹腔注射免疫鼠（加佐劑）刺激產(chǎn)生顯著的血清抗體應(yīng)答。 大腸桿菌/艾美球蟲子孢子蛋白的118氨基酸與-半乳糖苷酶融合:接種雞，可產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。 4. 沙門氏菌,細(xì)菌性活載體,能運(yùn)送抗原至腸道淋巴組織，并引起分泌免疫反應(yīng)，其中分泌性IgA浸潤所有粘膜表面及外分泌腺體的分泌物中。 傷寒沙門氏菌在人體、鼠傷寒沙門氏菌在小鼠能在寄主腸道中定居，并在腸道淋巴組織、肝和脾中增殖。 沙門氏菌人工突變后，它們?nèi)阅茉谀c道淋巴組織中定居。 這些特征使減毒沙門氏菌可能作為表達(dá)各種定居因子、毒性抗原基因的載體，來遞呈這些抗原到腸道淋巴組織。,沙門氏菌活疫苗載體特性,營養(yǎng)缺陷質(zhì)粒補(bǔ)救系統(tǒng)：該系統(tǒng)的寄主是某一營養(yǎng)代謝物的染色體突變株，而轉(zhuǎn)移質(zhì)粒則帶有與寄主突變互補(bǔ)的非同源基因。 整合表達(dá)系統(tǒng)：即將外源基因整合到載體的染色體中。 細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)：即將外源基因產(chǎn)物表達(dá)到載體細(xì)胞表面，有利于與免疫系統(tǒng)接觸。 鞭毛表達(dá)系統(tǒng)：由于鞭毛是存在于細(xì)胞表面的運(yùn)動器，與鞭毛蛋白融合在一起的抗原蛋白也將存在于細(xì)胞表面，同樣有利于與宿主的免疫系統(tǒng)接觸。,幾種沙門氏菌活載體表達(dá)系統(tǒng),病毒抗體復(fù)合物疫苗 （virus-antibody complex vaccine）,該類疫苗由特異性高免血清或抗體與適當(dāng)比例的相應(yīng)病毒組成。 可以延緩病毒釋放，提高疫苗安全性和免疫效果，其關(guān)鍵是病毒與抗體的比例要適度。 目前，已研制成功并被批準(zhǔn)投放市場的有傳染性法氏囊病毒抗體復(fù)合物疫苗（美國）。,滅活疫苗（inactived vaccine）,該類疫苗由完整病毒（或細(xì)菌）經(jīng)滅活劑滅活后制成，其關(guān)鍵是病原體滅活。 既要使病原體充分死亡，喪失感染性或毒性，又要保持病原體免疫原性。 目前，常用的滅活劑有甲醛、乙酰乙烯亞胺（AEI）、乙烯亞胺（BEI）和-丙酸內(nèi)酯等,亞單位疫苗（subunit vaccine）,是指病原體經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，除去其無效的毒性物質(zhì)，提取其有效抗原部分制備的一類疫苗。 病原體的免疫原性結(jié)構(gòu)成分包含多數(shù)細(xì)菌的莢膜和鞭毛、多數(shù)病毒的囊膜和衣殼蛋白，及有些寄生蟲蟲體的分泌和代謝產(chǎn)物，經(jīng)提取純化，或根據(jù)這些有效免疫成分分子組成，通過化學(xué)合成，制成不同的亞單位疫苗。 人工合成物純度高，使用安全。,肺炎球菌囊膜多價(jià)多糖疫苗 流感血凝素疫苗 牛和犬的巴貝斯蟲病疫苗等,用DNA重組技術(shù)，將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因?qū)朐嘶蛘婧思?xì)胞，使其在受體細(xì)胞中高效表達(dá)，分泌保護(hù)性抗原肽鏈。提取保護(hù)性抗原肽鏈，加入佐劑即制成基因工程重組亞單位疫苗。,重組亞單位疫苗 recombinant subunit vaccines,優(yōu)點(diǎn)：,安全性好：不含傳染性材料，接種后不會發(fā)生急性、持續(xù)或潛伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情況。 減少或消除了常規(guī)疫苗有害的反應(yīng)原：熱原、變應(yīng)原、免疫抑制原等 穩(wěn)定性好：便于保存和運(yùn)輸，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相區(qū)別，因此更適合于疫病的控制和消滅計(jì)劃。 將高度危險(xiǎn)和致病的病原體的免疫原性蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)移到不致病而且無害的微生物，用于大量生產(chǎn)，安全性更好。 用于外來病原體和不能培養(yǎng)的病原體，擴(kuò)大了用疫苗控制疫病的范圍。,表達(dá)系統(tǒng)： 原核生物：E.coli；枯草桿菌（Bacillus subtilis） 真菌 昆蟲細(xì)胞 哺乳類細(xì)胞 關(guān)鍵：研究和了解在各種表達(dá)系統(tǒng)中基因表 達(dá)和產(chǎn)物穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)和控制參數(shù),抗獨(dú)特型疫苗（ant-idiotypic vaccine）,根據(jù)免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說原理，利用第一抗體分子中的獨(dú)特抗原決定簇（抗原表位）所制備的具有抗原的“內(nèi)影像”（internal image）結(jié)構(gòu)的第二抗體。 該抗體具有模擬抗原的特性，故稱之為抗獨(dú)特型疫苗。 它可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，主要適用于目前尚不能培養(yǎng)或很難培養(yǎng)的病毒，及直接用病原體制備疫苗有潛在危險(xiǎn)的疫病。,DNA 疫 苗,裸DNA (Naked DNA) 病毒攜帶體（Viral delivery） 細(xì)菌攜帶體（Bacterial delivery）,基因疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由編碼能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原的基因片段和載體構(gòu)建而成。,基因疫苗被注入機(jī)體并吸收入宿主細(xì)胞后，病原體抗原的基因片段在宿主細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)并合成抗原，這種細(xì)胞內(nèi)合成的抗原經(jīng)過加工、處理、修飾提呈給免疫系統(tǒng)，激發(fā)免疫應(yīng)答。其刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過程類似于病原微生物感染或減毒活疫苗接種。,基因疫苗免疫機(jī)理, 目的基因的分析 選擇合適的表達(dá)載體 測序確認(rèn)編碼序列 體外轉(zhuǎn)錄翻譯驗(yàn)證試驗(yàn) 動物試驗(yàn) 結(jié)果評價(jià),研制基因疫苗的基本步驟,轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的抗原蛋白經(jīng)純化后仍保留了 免疫學(xué)活性，注入動物體內(nèi)能產(chǎn)生特異性抗體； 用轉(zhuǎn)基因植物組織飼喂動物，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá) 的抗原遞呈到動物的腸道相關(guān)淋巴組織，產(chǎn)生 粘膜和體液免疫應(yīng)答。,轉(zhuǎn)基因植物疫苗（transgenic plant vaccine）,食用疫苗（edible vaccine）,1. 整合表達(dá)系統(tǒng)： 把編碼病原體保護(hù)性抗原基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)，并整合到細(xì)胞染色體上，形成表達(dá)疫苗的植物品系。 2. 瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)： 用植物病毒為載體，將編碼疫苗抗原的基因插入植物病毒基因組中。再用此重組病毒感染植物，抗原基因隨病毒在植物體內(nèi)復(fù)制、裝配而得以高效表達(dá)。,轉(zhuǎn)基因植物基因工程疫苗的表達(dá)系統(tǒng),按疫苗抗原種類和數(shù)量，疫苗又可分為單（價(jià)）疫苗、多價(jià)疫苗和多聯(lián)（混合）疫苗,單（價(jià)）疫苗（univalent vaccine）：利用同一種微生物菌（毒）株或同一種微生物中的單一血清型菌（毒）株的增殖培養(yǎng)物制備的疫苗稱為單（價(jià)）疫苗 多價(jià)疫苗（polyvalent vaccine）：指用同一種微生物中若干血清型菌（毒）株的增殖培養(yǎng)物制備的疫苗。 多價(jià)疫苗能使免疫動物獲得完全的保護(hù)力，且可在不同地區(qū)使用。 鉤端螺旋體二價(jià)及五價(jià)活疫苗、口蹄疫A、O型鼠化弱毒疫苗等。,混合疫苗（mixed vaccine）：又稱多聯(lián)疫苗，指利用不同微生物增殖培養(yǎng)物，按免疫學(xué)原理和方法組合而成。 接種動物后，能產(chǎn)生對相應(yīng)疾病的免疫保護(hù)，具有減少接種次數(shù)和使用方便等優(yōu)點(diǎn)，是一針防多病的生物制劑。,按疫苗病原菌（毒）株的來源，